SC_T 7220-2015中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法.pdf

ICS 65.020.30B 50Sc中华人民共和国水产行业标准SC/T 7220—2015中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法PCR detection method of Spiroplasma eriocheiris2015-02~09 发布2015-05-01实施中华人民共和国农业部3发布鲜+ SC/T 7220—2015前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业部渔业渔政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本标准起草单位：南京师范大学。本标准主要起草人：王文、孟庆国、顾伟、吴霆、李文杰、任乾、丁正峰。I SC/T 7220—2015引言本文件的发布机构提请注意如下事实，声明符合本文件时，可能涉及7.2中华绒鳌蟹螺原体PCR检测与《螺原体病原微生物的PCR快速检测技术》（专利号：ZI.200510041005X)等相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下。就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人：南京师范大学地址：江苏省南京市文苑路1号南京师范大学生命科学学院请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。1I SC/T 7220-2015中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法１范围本标准规定了对中华绒鳌蟹螺原体病原分离、纯化以及PCR检测的方法。本标准适用于中华绒鳌蟹等水生甲壳动物（包括中华绒鳌蟹Eriocheir sinensis、凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei、克氏原整虾 Procambarus clarkii、罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii，下文均是以中华绒鳌蟹为对象)中华绒鳌蟹螺原体感染的流行病学调查、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SC/T 7103水生动物产地检疫采样技术规范SC/T 7202.2--2007斑节对虾杆状病毒(MBV)病诊断规程第2部分:PCR检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1中华绒螯蟹螺原体spiroplasma eriocheiris具有体积小（可以滤过0.22μm孔径滤膜）、会运动、有螺旋结构、没有细胞壁、可以用人工培养基培养等特征。该病原侵染中华绒螯蟹血淋巴细胞后在其内大量繁殖形成包涵体，该病原还广泛侵染中华绒鳌蟹机体内所有器官（包括鳃、心脏、肝胰腺、肌肉、神经、消化道等)的结缔组织。螺原体侵染神经时，可以引起宿主附肢颤抖，最终导致被感染宿主死亡。4试剂和材料4.1Chelex-100悬浊液（5%）:称取5.0g Chelex-100混于100mL去离子水中，常温保存。4.2酒精：100%，分析纯。4.3蛋白酶K:20 mg/mL。4.4DL2000 DNA分子量标准。4.5 溴化乙锭(EB)：10 mg/mL。4.6琼脂糖：电泳级。4.7dNTP:10 mmol/L,含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 10 mmol/L的混合物，一20℃保存。4.8 Taq DNA 聚合酶:5 U/μL,一20℃保存。4.910XPCR缓冲液：一20℃保存。4.105XTBE电泳缓冲液。4.116X上样缓冲液。4. 12 引物 F1: 5- GATCAATCAATTGGTTTA - 3, R1: 5- GGTTAGTTCTCTCAGATAGTA-AGAA-3用无菌去离子水配制成10μmol/I，一20℃保存，用以扩增中华绒鳌蟹螺原体16srRNA23 s rRNA 间区序列。4. 1330.01 mol/L磷酸盐缓冲液 PBS。1 SC/T 7220—20154.14R2液体培养基：2.5gHIB,8g蔗糖，加双蒸水至84ml，121℃高压灭菌20min;15mL胎牛血清（56℃灭活0.5h）1mI酚红，100mg青霉素，0.22um滤器过滤灭菌；高压灭菌部分冷却至50℃以下与过滤灭菌部分混匀即得100mLR2液体培养基。4.15阳性对照为已知感染中华绒鳌蟹螺原体且中华绒鳌蟹螺原体分离培养和PCR结果显示阳性的中华绒鳌蟹肌肉组织提取的DNA，一20℃保存。4.16阴性对照为已知未感染中华绒鳌蟹螺原体且中华绒鳌蟹螺原体分离培养和PCR结果显示阴性的中华绒鳌蟹肌肉组织提取的DNA，一20℃保存。5仪器设备5.1医用镊子、医用解剖刀、医用剪刀。5.21 mL一次性注射器。5.3台式高速离心