SN 1673-2005对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1673--2005对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction (PCR)for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus of shrimp2005-09-30发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1673—2005前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘、史秀杰、何俊强、高隆英、杨锦舜、江育林。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1673—2005对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程1范围本标准规定了用聚合酶链反应技术检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的方法。本标准适用于对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测及鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvIS(）3696:1987）3试剂和材料3.1水：符合GB/T6682—1992中一级水的规格。3.2Tαq酶：5U/μI，一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。3.3 dNTP:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。3.4引物：浓度为40 μmol/I。其序列如下：77012F:5-ATC GGT GCA CTA CTC GGA-377353R:5-TCG TAC TGG CTG TTC ATC-33.5无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。3.6矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。3.7标准分子量：推荐使用pUC19DNA/MspI（HpaIⅡ），各片段大小依次为501bp、404bp、331bp、242 bp、190 bp、147 bp。4器材和设备4.1PCR扩增仪。4.2电泳仪。4.3微量移液器及吸头。4.4#紫外观察灯或凝胶成像仪。4.5恒温培养箱。4.6普通冰箱和超低温冰箱。4.7离心机和离心管。4.8制冰机。5取样和制样5.1取样5.1.1取活或濒死的对虾组织作为样品，死亡2h后不可采用。处理前要将样品放在冰上。如果2 h1 SN/T 1673—2005以后才能处理，应将样品保存在95%乙醇中，乙醇体积是样品体积的10倍以上，放置在室温下可保存1个月。5.1.2仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作样品。取虾头时，用灭菌剪刀和镊子去除眼晴、头胸甲、所有的胸部附器和头部以后的腹部。5.1.3成虾,取附肢或血淋巴作为样品。取附肢时，用灭菌剪刀剪去头部和腹部两侧的附肢，如触角、颚足、步足和游泳足，用小剪刀剪碎。取血淋巴时，先用1mL针管吸取500μL10%的柠檬酸盐溶液（见第A.1章），然后在针管前插上一个26号的针头。抓往对虾，使腹部朝上。将针头水平地插人第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处。缓慢吸取血淋巴。血淋巴样品需保存在一70℃。5.2制样15℃条件下,在1.5mLEppendorf 管中首先加人25mg～100 mg 组织或200 μL血淋巴柠檬酸盐混合液，加人150μLCTAB溶液（见第A.2章），用勾浆器将样品匀浆成糊状。再加CTAB溶液到900 μI。混匀后置于25℃作用2 h。6IHHNV 核酸的鉴定6. 1 核酸抽提首先加800μL抽提液1（见第A.3章），充分混合至少30s：12000r/min离心5min，取上层水相；再加700μL抽提液2（见第A.4章），充分混合30s;12000r/min离心5min，取上层水相；然后加人1.5倍体积的一20℃无水乙醇，混匀后，一20℃放置6h以上；15000r/min离心30min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，37℃干燥20 min或抽真空干燥；最后加12μL水溶解后，作为PCR模板。6.2 PCR 扩增反应体系为100 μL:水 62 μL、dNTP 2μL、上游引物和下游引物各2.5 μL、25 mmol/L氯化镁(MgCl2）(见第 A.5章)10 μl、10倍 Taq酶浓缩缓冲液（见第 A.6章)10 μl、模板 10 μuL、Taq酶 1μL。如使用无热盖的PCR扩增仪，需在反应混合物上覆