SN_T 4073-2014芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4073—2014芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法Detection and identification of Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局意真优 SN/T 4073-2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、福建农林大学。本标准主要起草人：王念武、黄伙水、陈劲松、沈建国、王宏毅、翁瑞泉、黄振、胡方平。1 SN/T 4073-2014芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法1范围本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境芒果的果实、叶片、枝条，组织繁殖材料中可能携带芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定。2芒果细菌性黑斑病菌基本信息学名:Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae分类地位：变形细菌门（Proteobacteria），-变形细菌纲（Gammaproteobacteria），黄单胞菌目（Xanthomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas）、黑腐黄单胞菌（Xanthomonascampestris）、黑腐黄单胞菌芒果致病变种（Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae）传播途径：远距离传播主要靠带菌苗木、接穗和果实的调运。其他信息参见附录A。3方法原理根据芒果细菌性黑斑病菌的致病基因hrpB特有碱基序列设计引物进行PCR扩增，并结合半选择性培养基上的培养性状，对该菌进行检疫鉴定。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备PCR仪、高压灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、天平（感量：0.001g）、高温干燥箱、震荡培养箱、生物安全柜、可调移液枪。4.2主要试剂半选择性培养基NCTM3和NA培养基试剂见附录B,PCR检测试剂见附录C。5检测鉴定方法5.1症状检查仔细观察芒果的果实，叶片和枝条，症状描述参见附录A。5.2检疫样品的采集及制备取有疑似症状的芒果果实、叶片、枝条等进行实验室检测鉴定。1 SN/T 4073—20145.3特异性引物的PCR初筛提取可疑样品DNA，采用特异性引物Xcm1/Xcm2进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C。5.4细菌分离培养半选择性培养基NCTM3分离，取疑似症状的样品（参见附录A），用清水冲洗干净，晾干后用灭菌的解剖刀在病健交界处取一小块病变组织，悬浮于少量无菌水中，用无菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在NCTM3培养基（配制方法见附录B)、平皿上划线分离，28℃下恒温培养5d。挑取疑似单菌落（圆形，乳白色，黏液状，中央隆起，边缘清晰，大小3.0mm～4mm），划线纯化四次后备用。5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认采用特异性引物Xcm1/Xcm2对分离疑似菌株进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C。6结果判定6.1在5.3特异性引物的PCR初筛中，若出现阴性结果，则判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌，若出现阳性结果，继续5.4细菌分离试验。阳性、阴性结果的判定见附录C。6.2在5.4细菌分离的基础上，若未出现疑似菌落，则判定样品未携带芒果细菌性黑斑病菌，若出现疑似菌落，则需5.5特异性引物PCR扩增继续判定。6.3在5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认中，若出现阳性结果，则判定为样品带有芒果细菌性黑斑病菌：若出现阴性结果，判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌。阳性、阴性结果的判定见附录C。7样品保存7.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出的芒果细菌性过斑病菌的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌杀死病菌后方可做丢弃处理。7.2菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为芒果细菌性过斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于NA培养基斜面上，28℃培养48h，然后4℃冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加入20%灭菌甘油并混匀，一80℃长期保存或用安管冷冻干燥长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。7.3结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实