NY_T 2472-2013西瓜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 67.080.10B 31NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2472—2013西瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法Identification of watermelon varieties-SSR marker method2013-12-13发布2014-04-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2472—2013目次前言范围规范性引用文件2原理·3仪器设备及试剂溶液配制引物...6参照品种8操作程序9等位变异数据采集10判定标准·...附录A（规范性附录）仪器设备及试剂附录B(规范性附录）溶液配制附录C(规范性附录）核心引物..T NY/T2472—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起草单位：新疆农业科学院农作物品种资源研究所、北京市农林科学院蔬菜研究中心、新疆农业科学院核技术生物技术研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：马艳明、许勇、张海英、陈勋基、陈果、郭绍贵、宫国义、刘志勇、足木热木·吐尔逊、肖菁、颜国荣。Ⅱ NY/T2472—2013西瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记进行普通西瓜（Citrul-luslanatussubsp.Vuaris和Citrulluslanatus subsp.Lanatus）品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于普通西瓜DNA分子数据的采集种鉴定集和品PUBLISHING2规范性引用文件RD文件的应用是必不下列文件对于本少的。凡是注日期的注日期的版本适用于本文文体版YOL件。凡是不注日期单的引包括所有的修改tGB/T 3543非物种扦样程RESA3原理s于西瓜SSR广泛分因组中同品种间单SSR位点重复单位的TT针对两侧序口贝的借单重复序列高度保守和单，根据其两侧的亲列设寸特异引物ARCHR支术对重复序的ER产物在电的电列进行扩增，早至量大小不易作经硝酸银染性由子力D检色或者荧光爽西瓜则区分开于不同普通《品种遗传组成不同，所以染料DNA序列存示下在差异或引物结合部位间大小存在差异，即可鉴定普通西瓜品4仪器设备及试代剂仪器设备剂见附录及5溶液配制Q溶液配制方法附B人6引物引物相关信息见附7参照品种参照品种的名称见附录C。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。8操作程序8.1重复设置设定2次生物学重复。8.2样品准备种子样品的扦样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。每个品种分取2个样品，每个样品检测30个个体（种子、叶片或其他器官组织），混合分析。对一致性差的样品每个个体单独分析。1 NY/T 2472—20138.3DNA提取采用CTAB法。选取植株下胚轴或幼嫩组织30mg～40mg置于2.0ml离心管中，用液氮研磨至粉状，加人700uL2%CTAB预热缓冲液，65℃水浴1h，加人700μL24：1氯仿一异戊醇，混匀，11200g离心10min；吸取上清液加人预先装有700μL异丙醇的1.5mL的离心管中，混匀后放一20℃冰箱30min，11200g离心10min；弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加人100uLddH2O，待充分溶解后检测浓度。一20℃保存留用。注：以上为推荐的一种DNA提取方法。其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。8.4PCR扩增8.4.1反应体系SSR反应体系，包括每种dNTP0.25mmol/L，正向引物0.2μmol/L，反向引物0.2μmol/L，TagDNA聚合酶1.0U，10XPCR缓冲液（含Mg²+），样品DNA60ng，其余以超纯水补足。推荐使用15uL或20uL反应体积。利用DNA分析仪检测时使用荧光标记的引物。每种引物的荧光染料种类见附录C注：反应体系的体积可以根据具体情况进行调整。8.4.2反应程序94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环34次；最后72℃延伸10min。4℃保温待用。8.5PCR产物检测8.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测清洗玻璃板用自来水将玻璃板洗净，晾干，再用95%的酒精擦洗1遍，干燥。在2mL离心管中加入1mL无水乙醇，4μuL亲和硅烷原液，摇匀，均匀涂在无凹槽玻璃板上。在通风橱中用0.5mL疏水硅烷工作液均匀涂布凹槽玻璃板，操作过程中两块玻璃板分别处理，防止互相污染。组装玻璃板待玻璃板彻底干燥后，将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧，盖上凹槽玻璃板，