SN_T 4821-2017牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4821--2017牛脊椎畸形综合征TaqMan 探针PCR检测方法Detection method for bovine complex vertebralmalformation by TaqMan PCR2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4821—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴晓薇、刘中勇、贾广乐、彭小莉、陈茹、朱道中、鱼海琼、刘志玲、段燕瑜、林志雄。 SN/T 4821—2017牛脊椎畸形综合征 TaqMan 探针 PCR检测方法1 范围本标准规定了牛脊椎畸形综合征（参见附录A)TaqMan探针PCR的检测方法。本标准适用于快速筛查牛群中隐性牛脊椎畸形综合征基因携带者。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件：CVM脊椎畸形综合征(Complex Vertebral Malformation)TaqMan 探针 TaqMan 探针(TaqMan probes)PCR 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)Ct值荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Cycle threshold)SNP单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism)原理4TaqMan法的SNP分型检测技术的原理：在普通聚合酶链反应的基础上时，加人一对两端有不同荧光标记的特异性探针来识别不同的等位基因（allelel和allele2）。5’端为报告荧光基团（reporter），3端为淬灭荧光基团（quencher）。两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异性退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光；当特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5到3外切酶活性，荧光报告基团被切割下来，脱离了3端淬灭荧光基团的淬灭作用（quench）从而发出荧光信号。根据检测到荧光信号的不同，可以判断相应样本的SNP 等位基因型。5仪器设备和试剂耗材5.1仪器与设备荧光定量PCR仪。恒温水浴锅。台式冷冻离心机（转速可达到12000r/min）。1 SN/T 4821—2017漩涡混匀器。冰箱(2℃～8℃、-20℃、-80℃)。微量可调移液器（10 μL、100μl、1000 μL)及配套吸嘴。Ⅱ级生物安全柜。5.2 试剂与耗材5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。5.2.2DEPC水：按照附录B制备，推荐使用商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。5.2.3饱和酚和异丙醇：分析纯,使用前预冷至--20℃。5.2.4酉酚：三氯甲烷：异戊醇混合液：配制方法见附录B。5.2.575%乙醇：配制方法见附录B。5.2.6荧光 PCR试剂盒。5.2.710%SDS:配制方法见附录B。5.2.8阳性对照为采集阳性牛的血液样品，阴性对照为采集阴性牛的血液样品，均保存于一20℃备用。6引物与探针序列上游引物(CVM-F)5-AGC TGG CTC ACA ATT TGT AGG T-3下游引物(CVM-R)5-CTC AAA GTA AAC CCC AGC AAA GC-3扩增序列参见附录CPROBE1:5′ VIC:TCATGGCAGTTCTCA-BHQ-3PROBE2:5′FAM:TCATGGCATTTCTCA-BHQ-3采用DEPC水将每条引物和探针配制成100μmol/L储存液，置一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10 μmol/L工作液，避免多次冻融。7样品采集、保存及运输采集牛的抗凝血，冷藏储存与运输。8　DNA提取8.1将血液样品 200 μL,加人2mL塑料离心管中,加 20 μL蛋白酶 K,再加10%SDS 20 μL,混匀。8.2混合液置于55℃水浴2.5h。8.3向匀浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡5min后12000r/min离心5 min。8.4吸上层水相400μL于一灭菌塑料离心管中，再次加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液