原位杂交技术.pptVIP

李成仁 组织胚胎学教研室 Tel：752220，Email：lichengren@;;一、核酸分子原位杂交的基本概念;(二) 基本原理;;定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开 成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、 甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 ;解链曲线; 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。;(一)定义：;(二)探针的分类;1. cDNA(complementary DNA);优点： ⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解 ; 根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成 优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透) 缺点：特异性较低（短链和简单）;1. 标记物 3H、32P、35S、125I等。 ; (2)非放射性标记物 生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 ;;;地高辛标记探针的显色检测 ;Diao HL. 2007. Fertil Steril;2. 标记方法;②随机引物法;(2)RNA探针标记 在体外转录技术中与探针制备同时完成 (3)寡核苷酸探针标记 末端转移法;;原位杂交技术的基本步骤与原理 原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的 包括：组织和器材的特殊处理 取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析 ;（一）器材的特殊处理;;(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。;;所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％ 多聚甲醛溶液内，置4℃冰箱内2-4小时。 再将组织移入30％蔗糖PBS溶液内，4℃冰箱内过夜。 次日可将标本储存于-80℃ 低温冰箱内保存。 ;组织制??? 冷冻切片以厚5~30um最佳。 40℃烤箱内干燥2小时后储存在-80℃超低温冰箱 在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存数月之久 石蜡切片，一般不提倡浸入二甲苯溶液。;(三)杂交预处理; 2.增强标本通透性与核酸探针穿透性 常用方法：蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐处理和稀酸洗涤等 (1)蛋白酶K（甘氨酸）、胃蛋白酶（4％多聚甲醛后固定） 酶的浓度和孵育时间应视标本种类、固定剂种类、切片厚度等而确定; (2)去污剂处理 Triton X-100最常用 注意：去污剂处理不当，会引起靶核苷酸的丢失，影响标本的形态结构 (3)酸酐处理和稀酸洗涤 防止探针与标本内的碱性蛋白发生静电效应，减少杂交反应的背景色;3. 预杂交 杂交之前使用不含核苷酸探针的杂交液在杂交温度下预先孵育切片，以达到封闭或阻断与核苷酸探针产生非特异性杂交点，降低背景着色的目的。; 标记的探针与检测标本上的靶序列结合而形成杂交体的过程。 这是原位杂交技术的关键步骤。 包括：探针的准备 双链核酸的变性 杂交反应;探针长度：50－100个碱基最佳 探针标记物：地高辛（DIG） 探针浓度：0.5－5.0μg/ml; 杂交液的量要适当，以10～20μl/每张切片为宜 ;理论热变性温度：90℃－95 ℃ 甲酰胺法：常规的加入30～50%甲酰胺于杂交液中 每增加1%，Tm值降低0.72℃，降至37-40 ℃为宜 注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。;探针——预变性的探针 高浓度盐类(柠檬酸钠)——增加杂交体的稳定性 甲酰胺——可降低解链温度 硫酸葡聚糖——对DNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度 牛血清白蛋白和鲑鱼精DNA或RNA——用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。;方法：杂交液滴于切片上，加盖硅化的盖玻片。 杂交的温度：在Tm-25℃