SN_T 3457-2012植物病毒分子生物学检测规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3457-2012植物病毒分子生物学检测规范Criterion on detection of plant virus by molecular biology2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局涂层查真伪 SN/T 3457—2012言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北仑出人境检验检疫局。本标准主要起草人：梁新苗、邓丛良、郭立新、陈红运、周琦、边勇、汪万春、李桂芬、郑耘、朱水芳?李建光。1 SN/T 3457—2012植物病毒分子生物学检测规范1 范围本标准规定了进出境植物检疫工作中植物病毒、类病毒的分子生物学检测方法与要求。本标准适用于进出境植物及植物产品中植物病毒、类病毒的分子生物学检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1聚合酶链式反应 polymerase chain-Teaction;PCR简称PCR技术。模板DNA先经高温变性为单链，两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火,在DNA聚合酶的作用下/以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。3.2reverse transcription/polymerase chain reaction ; RT-PCR反转录-聚合酶链式反应简称RT-PCR，以提取组织或其他材料中的RNA为模板，采用Oligo(dT）、随机引物或特异性引物，在反转录酶和适宜的反应条件下RNA被反转录成 DNA；然后再以cDNA作为模板，进行 PCR扩增。3.3实时荧光 PCR real-time fluoescence PCR在常规 PCR的基础上,在引物对所扩增序列段中,加入一条特异性的寡核苷酸荧光探针,探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子游离产生荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3. 4Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 SN/T 3457--20123.5核酸杂交技术nucleic acid hybridization两段来源不同的核酸分子（两种单链DNA分子之间、一种单链 DNA分子与一种单链 RNA分子或两种单链RNA分子之间)具有一定的同源性，在去掉变性条件后，互补的区段能够退火复性形成异质双链分子。这一过程称为核酸杂交。3.6核酸序列测定nucleic acid sequencing通过化学方法测定基因片段中的核苷酸排列顺序，目前用于测序的技术主要有 Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert发明的化学降解法。3.7基因芯片技术gene-chip detection又称DNA芯片技术，是指将探针DNA有序地固定于玻片或其他固相载体上，测试样品的核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的探针按碱基配对原理同时进行杂交，洗去未互补结合的片段。然后通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，用计算机软件进行数据的比较和分析，从而获取样品分子的数量和序列信息。4原理植物病毒是类由核酸和蛋白质外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生病原物，可分为DNA病毒和RNA病毒两大类。PCR方法、RT-PCR方法、实时荧光 PCR方法、核酸杂交、核酸序列测定和基因芯片技术，都是利用核酸碱基配对的性质，对样品中的病毒核酸进行检测。大部分植物病毒的核酸是RNA，要应用上述方法检测RNA类型的病原体，需要先提取样品中的总RNA，将RNA反转录成cDNA之后，才能以此为模板进行后续的检测。如果待检测的病毒为DNA病毒，则无需进行反转录，直接以提取的DNA为模板即可进行后续检测。5实验室总体要求及工作人员操作要求植物病毒分子生物学检测实验室的总体要求及工作人员操作要求按照SN/T1193。6安全防护从事植