SNT 2372-2009水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2372—2009水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法Identification of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae.Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola2009-09-02 发布2010-03-16实施中华人民共和国0发布究：国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2372--2009前言本标准的附录 C为规范性附录,附录 A、附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国湖南出人境检验检疫局负责起草，中国检验检疫科学院动植物检疫研究所、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局参加起草。本标准主要起草人：朱金国、朱水芳、莫瑾、陈红运、钟文英、赵文军、彭梓。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2372—2009水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法1 范围本标准规定了水稻种子和水稻材料的水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pr.oryzae)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的检测方法。本标准适用于进出口水稻种子中的水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的检测。田间种植材料和环境中水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的检测也可参照本标准进行。2 原理2.1分类地位水稻细菌性条斑病是由稻黄单胞菌条斑致病变种（Xanthomonas oryzae pr.oryzicola,Xcola)病原菌引起，水稻白叶枯病是由稻黄单胞菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)病原菌引起。这两种菌同属原核生物界（Procaryotae）、变形菌门（Proteobacteria）、丙型变形菌纲（Gammapro-teobacteria）、黄单胞菌目（Xanthomonadales）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）、黄单胞菌属（Xan-thomonas).2.2鉴定原理水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌间的生理生化差异是检测区分两种病原菌的重要依据（参见附录A和附录 B)。3设备和材料3.1恒温培养箱：28℃±1℃。3.2显微镜：物镜头10×～100×。3.3天平：精度0.001g。3.4高压灭菌器。3.5冰箱:0℃～4℃。3.6均质器:8 000 r/min～10 000 r/min。3.7灭菌的样品处理器具：镊子、剪刀、称量勺。3.8吸管:1 mL,分刻度0.1 mL、10 mL,分刻度1 mL。3.9灭菌平皿:直径 90 mm,底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平Ⅲ。3.10灭菌小试管:3mmX50mm。4 培养基和试剂4.1SPA培养基：见附录 C第 C.1章。4.20.001%吐温20-磷酸盐缓冲液。4.3革兰氏染色试剂。4.4鞭毛染色试剂:见附录 C第 C.2 章。4.5明胶液化培养基：见附录C第 C.3章。4.6氧化酶试剂。1 SN/T 2372—20094.7过氧化氢酶试验试剂。4.8石蕊牛乳试剂:见附录 C第 C.4 章。4.9 糖氧化和发酵测定培养基:见附录 C第 C.5 章。4.10碳源利用试验培养基:见附录 C第 C.6 章。4.11水杨苷产酸试验培养基：见附录 C第 C.7章。4.122,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)。5样品处理及分离培养5.1水稻种子大量种子样品通常需先用灭菌蒸馏水冲洗以除去残片和表面的污染杂菌，以避免杂菌太多产生干扰。清洗后称取10g或400粒种子放人0:001%吐温-磷酸缓冲液净低温（5℃～15℃）浸泡4h～6h，用均质器充分打碎，制各样品提取液。一果是检测少量的种子样品，取_20粒种子加入10mL灭菌的磷.抗酸缓冲液，用灭菌槌和研钵或是搅拌器将种子完全压碎制成提取液将样品提取液于 22℃～25℃环境中放置4h～6h。旋涡混匀悬浮液5min，制备10×、100×和1000×三个稀释度的悬浮液，从原液及每个梯度稀释液中取 0.3mL,分别放人到3个 SPA 的平血中（每个平皿加人0.1mL)。用 L-型玻离棒将液体均匀涂布在SPA琼脂的表面。也可用水稻白叶枯菌或水稻细菌性条斑病菌的ELISA试剂盒对提取液进行快速筛选检测具体检测方法参照试剂盒说明手册），ELISA检测阴性可报告结果，阳性结果再进行进一步的平板分离利生化鉴定。若提取液杂菌较多，可考虑增加稀释梯度和接种平板的数量以提高检出率。5.2植物组织材料5.2.1 无症状的组织可将10g左右样品直接放入90mL0.g01%哦温-磷酸缓冲液呷，均质1min制备成细菌悬浮液，可直接采用水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌进行 ELISA筛选试验，阳性结果再