SN_T 2734-2010传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2734—2010传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范Quarantine protocol for infectious salmon anaemia(ISA)2011-05-01实施2010~11-01发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码薄 SN/T 2734—2010言前本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准是参照世界动物卫生组织（OIE)《水生动物疾病诊断手册））（2009版）中第2.3.5章的有关内容，同时依据国外在该领域取得的研究成果的基础上制定而成。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局和中华人民共和国沈阳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：孔繁德、徐淑菲、刘、高隆英、林颖、陈信忠、龚艳清。 SN/T 2734—2010传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范馬范围1本标准规定了用于检测传染性鲑鱼贫血病的临床诊断、病毒分离、间接荧光抗体试验、RT-PCR方法和荧光定量RT-PCR等方法。本标准适用于传染性鲑鱼贫血病的流行病学调查、监测、诊断和出人境检验检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。ASK（atlantic salmon kidney cell line):大西洋鲑肾细胞系CHSE-214（chinook salmon embryonic cell line）:大鳞大麻哈鱼鱼胚细胞系CPE（cytopathic effect）:细胞病理变化DABCO（1,4-DiazabicycloL2.2.2}octane)：三亚乙基二胺，又名1,4-二氮杂二环辛烷DEPC（diethypyrocarbonite):焦碳酸二乞酯EB（ethidium bromide):溴化乙锭yanate）：异硫氰酸荧光素FITC (fluoescein isothioIFAT（indirect fluorescent antibody_test):间接荧光抗体试验ISA（infectious salmon anaemia）:传染性鲑鱼贫血病M-MLV逆转录酶（moloney,murine leukemia virus)：分离自莫洛尼氏鼠白血病病毒SHK-1（atlantic salmon head kidney):大西洋鲑前肾细胞系4试剂和材料4.1ISAV标准毒株、ISAV单克隆抗体、兔抗ISAV抗体、荧光标记的羊抗鼠IgG、荧光标记的羊抗兔IgG、细胞系（SHK-1、TO、ASK 或CHSE-214细胞）；由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。4.2水：试剂配制（见附录A)用水应符合GB/T6682中一级水的规格。4.3 Taq DNA 聚合酶。4.4 dNTP:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L4.5M-MLV 逆转录酶。4.6 RNasin:RNA 酶抑制剂。4.7引物：所选取的基因为ISAV的第8片段。合成的引物采用无DNA酶、无RNA酶的超纯水将引物与探针配制成100μmol/L储存液，置一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成20μmol/L工作1 SN/T 2734-2010液，避免多次冻融。普通 RT-PCR:引物浓度为 20 umol/L，扩增产物大小为 155 bp。引物序列如下：上游引物 1:5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′下游引物2:5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3荧光定量RT-PCR：引物和探针浓度为20umol/L，扩增产物大小为104 bp。引物和探针序列如下：上游引物 3:5′-CTACACAGCAGGATGCAGATGT-3′下游引物4:5′-CAGGATGCCGGAAGTCGAT-3′探针:5-FAM-CATCGTCGCTGCAGTTC-TAMRA-34.8异丙醇:分析纯,使用前预冷到一20℃。4.9无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。4.10　标准分子量 Marker:推荐使用100 bp 入DNA Marker。5仪器和设备5.1电动匀浆器。5.2倒置显微镜。5.3荧光显微镜。5.4冷冻切片机。5.5 高速冷冻离心机。5.6 电泳仪。5.7 PCR扩增仪。5.8荧光定量扩增仪。5.9紫外观察灯或凝胶成像仪。6以临床和病理变化为基础的诊断6.1肉眼观察行为和病理变化肉眼观察行为和病理变化如下:腮(腮部血液瘀积除外):外观苍白,贫血的结果,这是最突出