SNT 1315-2010牛地方流行性白血病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1315-2010代替 SN/T 1315--2003牛地方流行性白血病检疫技术规范Protocol of quarantine for enzootic bovine leukosis2010-01-10 发布2010-07-16 实施rO中华人民共和国1858151空询真拉发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1315--2010前言本标准代替SN/T1315一2003《牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与SN/T 1315一2003相比，主要变化如下：-标准名称改为《牛地方流行性白血病检疫技术规范》；一增加了临床诊断部分；~实验室诊断增加了病原分离鉴定、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和核酸检测方法：一对已有的琼脂凝胶免疫扩散试验的操作方法和结果判定进行了修订完善，本标准的附录 A、附录 B、附录 C均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：乔彩霞、张鹤晓、赖平安、高志强、吴丹、蒲静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1315—-2003。 SN/T 1315—2010牛地方流行性白血病检疫技术规范1范围本标准规定了牛地方流行性白血病临床诊断和实验室诊断的操作内容。本标准适用于牛地方流行性白血病的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T 1917牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程3缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 1EBL牛地方流行性白血病。3. 2BLV牛白血病病毒。3.3FBL胎牛肺。3. 4RIA放射性免疫试验。3.5PCR聚合酶链反应。3.6AGID琼脂凝胶免疫扩散。3.7ELISA酶联免疫吸附试验。4临床诊断4.1 流行病学牛感染BLV后将终生带毒，成为传染源，其传播方式有垂直传播和水平传播两种。该疫病自1878 年发现于德国以来，目前在德国、波兰、罗马尼亚和前苏联等多数国家均有发生，而与我国近邻的 SN/T 1315—2010日本也因输人性传播导致该病在全国蔓延。4. 2 临床症状牛白血病的潜伏期较长，可达 4 年～5 年，多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存在白血病抗体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。疫病发展形成肿瘤后则出现淋巴结肿大和一些组织脏器的生理机能障碍,并表现体重减轻、贫血和泌乳减少等症状。4.3病理变化感染BLV后，病牛会出现淋巴结肿大，遍及全身各个脏器,形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿病灶。特别是真胃、心脏和子宫等为最常发的器官。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出牛地方流行性白血病的初步诊断,进一步的确诊有赖于实验室诊断。5 实验室诊断5.1病原分离及鉴定5.1.1 原理BLV 是一种外源反转录病毒,其主要靶细胞是 B淋巴细胞。BLV 不仅以前病毒的形式存在于感染牛的血液淋巴细胞和肿瘤细胞中，而且存在于动物体的客种体液（鼻腔、支气管渗出液，唾液和牛奶等)中，利用外周血液血淋巴细胞可对其进行培养分离，然后用电镜或BLV抗原测定法鉴定。也可直接用 PCR 检查外周血和肿瘤中存在的BLV 前病毒-DNA。5.1.2材料准备器材和设备：无菌注射器倒置光学显微镜，二氧化碳培养箱，冰箱（一20℃保存血清，L、100 μL），微量滴头，吸管（5 mL、-70℃保存种毒），无菌96孔细胞培养板，微量可调移液器（50~u10 mL)。试剂：淋巴细胞分离液、20%胎牛血清的MEM培养液和细胞分散液配制见附录A。胎牛肺细胞：无菌采取出生犊牛肺,磨碎或剪碎，再用胰蛋白酶消化制备细胞，置37℃二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。5.1.3样品制备样品采集用无菌注射器或采血专用真空管针无菌灰牛静脉采血并迦入抗凝剂，采集样品立即放人4℃冰箱保存,在 24 h 内送到实验室。样品处理取1.5mL抗凝血，轻轻加人等量的淋巴细胞分离液，注意不要摇动打乱液层，2000r/min离心20 min,离心后分成多层,最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞,在血浆层与分离液之间是一层较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放人另一离心管中，以PBS洗涤后备用。5. 1.4 病毒分离取得到的淋巴细胞与2×10°FBL细胞在40mL含20%胎牛血清的MEM中共同培养，置于37℃ 5%二氧化碳培养箱,逐日观察细胞变化,并在3d～4d后收获培养物上清，保存于一70°℃