SN_T 3963-2014桃丛簇花叶病毒检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3963-—2014桃从簇花叶病毒检测方法Detection of Peach rosette mosaic virus2014-11-01实施2014-04-09发布中华人民共和国发布TW31国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3963—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：马云霞、张明哲、郭京泽、闻伟刚、李明福、朱水芳。 SN/T 3963—2014桃丛簇花叶病毒检测方法‧范围本标准规定了桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于桃树、葡萄等植物材料中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定。2原理桃丛簇花叶病毒学名:Peach rosette mosaic virus，缩写:PRMV。该病毒外壳蛋白的特异性及其基因组核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据。相关资料参见附录 A。3仪器设备、用具及试剂3.1仪器设备酶标检测仪、实时荧光PCR仪、低温冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、电子分析天平、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、制冰机等。2用具3.2微量可调移液器（量程分别为2.5 μL、10μL、100 μL、200 μL 和l mL)及灭菌的吸头、1.5mL离心管、研钵、酶联板、0.2mLPCR管、96孔PCR反应板及盖子等3.3试剂主要试剂、缓冲液、引物和探针序列等见附录B和附录 C。4检测与鉴定4.1血清学(双抗体夹心酶联免疫吸附测定)4.1.1包被抗体将 PRMV的抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度,加入酶联板中，每孔加人100 μL。将酶联板加盖(或用保鲜膜密封后)放人保湿盒中，置于37℃恒温箱中温育2h（或4℃冰箱过夜）。之后每孔加人300 μL PBST洗板 3次,每次 3 min。4.1.2样品制备称取待检植物叶片 0.2 g,加人2 mL样品抽提缓冲液，充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，5000 r/min离心5 min,取上清液，即为 1：10稀释的样品粗提液。4.1.3加样将样品粗提液加人已包被抗体的酶联板中，每孔加100μL。加缓冲液的孔作为空白对照，同时设1 SN/T 3963--2014置阴性对照、阳性对照。每个处理设置一个重复。然后将酶联板加盖或用保鲜膜密封后放人保湿盒中，置于37℃恒温箱中温育2h(或4℃冰箱过夜）。之后用PBST洗板3次，方法同4.1.1。4.1.4加酶标抗体用ECL缓冲液将碱性磷酸酯酶标记的PRMV酶标抗体稀释至工作浓度，加人酶联板孔中，每孔100 μL。置于 37℃条件下保温2 h,之后用 PBST洗板 3次，每次 3min。4.1.5加底物显色用新鲜配制的底物缓冲液配制质量浓度为1 mg/mL的pNPP溶液，加人酶联板，每孔100 μL。室温避光显色 30 min～60 min。4.1.6终止反应待阳性对照孔颜色反应较充分而阴性对照孔尚未有非特异反应出现时，每孔中加人33αL3 mol/L NaOH 中止反应。4.1.7读数用酶标读数仪测定OD405 nm值，记录实验结果。4.2PRMV的实时荧光PCR检测方法4.2.1样品制备和植物总RNA的提取取0.1g待检的植物叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5mL离心管中，然后加人1 mL的 Trizol,剧烈振荡摇勾;4℃，12 000 r/min离心10 min 以除去不溶的成分,将上清液转人一新的1.5 mL离心管中，室温下放置 5 min;加人0.2 mL 三氯甲烷，剧烈振荡 30 s，在室温下保持10 min～15 min 后,4 ℃，12 000 r/min 离心15 min;将上层水相转移到新的 1.5 mL离心管中，加0.5 mL异丙醇，上下颠倒混匀，室温下保持15min;4℃，12000r/min离心10 min,RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；弃去上清液，加人1 mL75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃，7500 r/min离心5 min，吸取上清液；沉淀于室温下充分干燥后,溶于 30 μL去离子水(DEPC处理)中，一20℃保存备用。4.2.2实时荧光 RT-PCR实时荧光 RT-PCR采用商品化的RT-PCR一步法试剂盒进行。每个样品及对照设2个平行处理。检测时以感染PRMV的植物材料作为阳性对照；在没有感染PRMV的植物材料作为阳性对照的情况下，可以用人工构建的阳性参考质粒分子或者以通过体外转录得到的含有待检核酸序列的RNA作为阳性对照（见附录 C）。以健康的植物材料中提取的总 RNA作为阴性对照;以水代替RNA作为空白对照。实时