SNT 2398-2010苹果丛生殖原体检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2398-2010苹果丛生植原体检疫鉴定方法Identification of candidatus phytoplasma mali2010-01-10 发布2010-07-16实施中华人民共和国发布Y国家质量监督检验检疫总局杂层拨 189荐查询真伤数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准苹果丛生植原体检疫鉴定方法SN/T 2398—2010*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www.spc. 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷字数 14千字开本880×1230 1/16印张 0.752010年4月第一次印刷2010年4月第一版印数1—1600*书号：155066·2-20695 SN/T 2398—2010前言本标准部分采用EPPO植物检疫标准（PM7/62(1)），主要技术差异如下：删除ELISA检测方法；删除指示植物鉴定方法；一添加电子显微镜观察方法。本标准的附录 B、附录 C、附录 D为规范性附录,附录 A 为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准参加起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：黄新、牟海青、邓从良、杨旭光、张祥林、王有福、朱水芳。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2398--2010苹果丛生植原体检疫鉴定方法1范围本标准规定了苹果丛生植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境苹果苗木及接穗中苹果丛生植原体的检疫和鉴定。2原理2.1分类地位苹果丛生植原体(Candidatus Phytoplasma mali,Apple proliferation phytoplasma,AP),软壁菌门，柔膜菌纲，不需固醇菌原体目，不需固醇菌原体科，植原体属，16SrX植原体组。2.2检测方法其生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。DAPI荧光染色方法操作简便成本低，在本标准中作为一种初步筛选植原体的方法;PCR技术灵敏度高、特异性好,RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中 PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定苹果丛生植原体的准确方法。3器材和试剂PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳役、凝胶成像系统。DAPI、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。4　检测鉴定方法4. 1 症状观察仔细观察苹果种苗、果实1叶片等,症状描述参见附录 A4.2DAPI 染色选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4’，6-二胀基-2-苯基吲哚)染色，在460 nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。4.3通用引物 PCR凝胶电泳及 RFLP检测通用引物 PCR凝胶电泳及 RFLP检测见附录 B。4.4特异性引物 PCR凝胶电泳检测特异性引物 PCR凝胶电泳检测见附录 C。4.5植原体形态观察对采集的植物样品制备超薄切片，通过电镜观察植原体形态方法见附录D。5 结果判定5.1表现症状与 A.1.1描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为苹果丛生植原体，但需通过5.2、5.3、5.4中任意方案进一步检测。5.2在 4.3检测中,若 PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且 RFLP分析片段大小与描述相符,可判定该样品携带苹果丛生植原体或16SrX组的植原体。 SN/T 2398--20105.3在4.4检测中,若通过 f01/r01引物PCR扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，而且 RFLP分析片段大小与描述相符，可判定该样品携带苹果丛生植原体。5.4在4.4检测中，若通过AP5/AP4引物PCR扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，可判定该样品携带苹果丛生植原体。5.5在4.5检测中，电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可判定该植物样品携带植原体。6样品保存与复核6.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出苹果丛生植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。6.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。6.3　复核由国家质