SN 1171.1-2003山羊关节炎-脑炎抗体检测方法 酶联免疫吸附试验.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1171. 1---2003山羊关节炎-脑炎抗体检测方法酶联免疫吸附试验Detection of antibodies against caprine arthritis-encephalitis virus--Protocol of enzyme-linked immunosorbent assay2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准山羊关节炎-脑炎抗体检测方法酶联免疫吸附试验SN/T 1171. 1-2003井中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16　印张 1/2字数 10 于字2003年6月第一版　2003年6月第一次印刷印数 12 000*网址 版权专有侵权必究举报电话：（010SN/T 1171. 12003前 言本标准根据OIE/chapter 2.4.4《诊断试验和疫苗标准手册》起草。本标推的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局标准法规研究中心。本标准主要起草人：杨宝华、崔路、曾宪生、张艳。本标准是首次发布的检验检疫行业标准。I SN/T 1171. 1-2003山羊关节炎-脑炎抗体检测方法酶联免疫吸附试验1范围本标准规定了应用酶联免疫吸附试验(ELISA)批量检测山羊血清中抗山羊关节炎-脑炎病毒抗体的方法。本标准适用于山羊关节炎-脑炎的流行病学调查、诊断、捡检疫和疫情监测。2 试验原理酶联免疫吸附试验（ELISA)的基本原理是将酶分子与抗体或抗体共价结合，此种结合不改变抗体的免疫反应活性和酶的生化活性，酶标记抗体可与吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，随后加人的底物可在酶分子的作用下呈现颜色反应，因而可借颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量呈正比，通过酶标仪可检测颜色反应的光密度值。本标准的反应原理就是将CAE病毒抗原包被在96孔聚乙烯微量板上，接着加人按一定比例稀释的待检血清，待反应一定时间后，加人酶标记的抗山羊免疫球蛋白抗体，反应完成后，加人底物显色并检测反应结果。3试验准备3.1仪器二氧化碳培养箱、酶标仪、倒置显微镜、超速离心机、高速离心机、细胞培养瓶、多孔道微量加样器、96孔聚乙烯微量板等。3.2 试剂3.2.1 TNE 缓冲液0. 01 mol/L Tris-HCl,pH7. 4,0. 01 mol/L 氯化钠,0. 001 mol/L EDTA。3. 2.2 洗涤液含 0.05%Tween-20的双蒸水。3. 2. 3pH7. 2PBS 溶液氯化钠8.00 g，氟化钾0.20g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.20g，水溶至1000mL。3.2.4高盐稀释液含0.05%Tween-20、10%小牛血清的0.5 mol/L氮化钠溶液。3. 3 标准抗原与血清制剂CAE种毒、标准抗原、阳性血清、阴性血清由指定单位提供。抗山羊IgG过氧化物酶结合物按市售说明书使用。4 试验程序4.1 ELISA 操作程序4.1.1于96孔聚乙烯微量板中加人用PBS(pH7.2)稀释的50μL最适稀释度的CAEV抗原，封口后置4℃48h，用洗涤液洗板二次，甩干后封口于一20℃保存备用（用前洗板四次）。1 SN/T 1171. 120034.1.2被检血清以高盐稀释液作1：20稀释,每孔加人 50μL,每个血清样品加二孔，每板设PBS对照二个,四个阴性对照和四个弱阳性对照,封口后于湿盒中 37℃反应2 h。4.1.3反应结束后，甩干板内液体，洗板六次，甩干后每孔加入 50μL用高盐稀释液稀释的抗山羊 IgG过氧化物酶结合物,封口后置37℃反应2 h。4.1.4反应结束后，连续洗板10次，甩干后每孔加人100μL底物（用0.1mol/L pH5.2柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.5mg/mL的邻苯二胺，并含0.1%过氧化氢），轻拍摇勾后置暗处反应10 min～15 min后，每孔加人50 μL.2 mol/I.硫酸终止反应。即刻在 492 nm波长下酶标仪检测光密度值(OD)。5试验结果的判定在标准阴性血清对照反应的 OD值全部小于0.1,弱阳性对照 OD大于等于 0.2时进行判断,OD值小于等于0.15时，判为阴性;OD值大于等于0.20时，判为阳性;OD值在0.15～0.20之间时判为可疑，所有可疑或只有一孔阳性反应的样品，都必须进行重复试验，若仍出现可疑结果则判其为阳