SN 1580-2005椰子死亡类病毒检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1580—2005椰子死亡类病毒检测方法Detection for Coconut Cadang-Cadang Viroid (CCCVd)2005-05-20 发布2005-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局安防车 SN/T 1580—2005前言本标罹的附录 A 和附录 B为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李继勇、李伟东、张勇。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1580---2005椰子死亡类病毒检测方法1范围本标准规定了植物检疫中椰子死亡类病毒的检疫检测方法。本标推适用于植物检疫中棕榈科植物(包括种果、苗木等繁殖材料)挪子死亡类病毒的检疫检测。2原理2.1 椰子死亡类病毒学名:Coconut cadang-cadang viroid缩写:CCCVd分类地位：椰子死亡类病毒属铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae），椰子死亡类病毒属（Cocadviroid),椰子死亡类病毒(Coconut cadang-cadang viroid)。2.2寄主范围自然寄主为椰子（Cocos nucifera）、长柄贝叶棕（Corypha elata）、油棕（Elaeis guineensis），人工接种寄主有槟榔（Areca catechu）、散尾葵（Chrysalidocaprus lutescens）、枣椰（Phoenir dactylifera）、大王椰(Roystonea regia)、圣诞椰(Veitchia merrilli)等。2.3地理分布菲律宾、所罗门群岛、西南太平洋、关岛、澳大利亚。2. 4 寄主症状早期叶片上产生小的、形状异常的亮黄或桔黄色斑点，并随叶龄增长而扩大，愈合成大的条纹状斑块，老叶出现黄化和斑驳。晚期叶子变小、减少，嫩叶易碎，最后只有几片直立的叶子，随之整个树冠死亡。病树花期推迟，花序变短呈圆形，花败落，不结果。果比正常小些，但数量增多，果实呈圆形，伸长或变形，挂果量减少,甚至不挂果，果破裂。2.5传播途径CCCVd的自然传播方式尚不清楚。CCCVd能够种传，种传率很低（小于0.3%）;CCCVd可通过花粉传播；通过机械方式，如切割植物组织或昆虫取食造成伤口，也可以传播该病害。2.6 基因组特征CCCVd的基因组为环状和线状,核酸为单链核糖核酸(SSRNA),以单体和二聚体共价联结的环状或线状分子存在。其共价闭合的环形的棒状结构,在变性处理后转变为环状分子，而不成为线状，这种环状 RNA分子在5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶中迁移率比相同分子量的线状分子要慢得多。2.7分子生物学特性在侵染不同阶段CCCVd至少有4种分子形态：低侵染力的小分子具246或247个核苷酸，第197个处有一额外的胞嘧啶。在分子的右末端为一可变区，在核酸右末端增加一个由 41个、50 或 55 个核苷酸重复序列，形成大分子的RNA链，具有296或297个核苷酸长链。CCCVd的RNA序列已测定。3仪器设备、用具及试剂3.1仪器设备PCR扩增仪、多功能电泳仪、冷冻高速离心机、紫外光透视仪、震荡器、冰箱、水浴锅、透射式电子显微镜、电子分析天平(感量为0.1 mg)等。3.2用具微量可调移液器(0. 01μL～2 μL,l μL～10 μL,10 μL～100 μL,10 μL～1 000 μL)、可调移液器1 SN/T 1580—2005头、刀片、Eppendorf管、研钵等。3.3试剂PCR 检测试剂(见附录 A)、聚丙烯酰胺凝胶电泳。4检验方法4. 1 症状检查仔细检查棕榈科植物繁殖材料的种果、苗木等是否有可疑症状。对于来自椰子死亡类病毒发生区域的植物材料，采集有可疑症状的植株叶片200g;如果没有发现任何可疑症状，随机取植株叶片200g。症状描述见 2.4。．4.2 RT-PCR 检测对采集的植物样品进行RT-PCR检测，方法见附录 A。4.3双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定对采集的植物样品进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,方法见附录B。5结果判定样品经 PCR检测为阳性,或双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定观察到 RNA 环状分子条带,即可判定样品中存在CCCVd。6样品保存与复核6.1样品保存检测表现阳性的植物样品经液氮干燥后，于一80℃下保存。保存样品做好登记和标记工作。6.2结果记录与资料保存完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色结果照片,PCR检测电泳阳性结果照片。6.3复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和