SN 1182.2-2004禽流感微量红细胞凝集抑制试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1182.2--2004禽流感微量红细胞凝集抑制试验Haemagglutination-inhibition test for avian influenza2004-06-01 发布2004-12-01实施中华人民共和国发布装双码防伪国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准禽流感微量红细胞凝集抑制试验SN/T 1182. 2—2004*中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.5字数8千字2004年10月第一版2004年10月第一次印刷*如有印装差错　由本社发行中心调换版权专有1侵权必究举报电话：（010SN/T 1182.2—2004前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：徐海聂、薛景山、潘文波、廖秀云、周思波、王小玉。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1182.2—2004禽流感微量红细胞凝集抑制试验1 范围本标准规定了用微量红细胞凝集抑制试验检测禽流感抗体的试验方法。本标准适用于禽类禽流感检疫、疫情监测和流行病学调查。2试剂和材料2.1试剂纯度所有化学试剂均为分析纯。2.2 pH7.2,0. 1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法见附录A。2.3红细胞泥配制方法见附录 A。2.41%鸡红细胞悬浮液将鸡红细胞泥用 PBS 稀释成1%悬浮液。2.5标准抗原禽流感 H5、H7、H9等标准抗原。2.6 标准血清禽流感 H5、H7、H9 等标准阳性血清和标准阴性血清。2.7被检血清2.7.1无菌采取动物血液，凝固后离心分离血清，置于4℃或20℃保存备用。2.7.2除鸡外其余禽的血清需先确定是否存在非特异性凝集。有特异性凝集的，血清按下列方法进衍处理：每0.5 mL 血清加 25μL鸡红细胞泥,轻轻振荡，静置 30 min,2000 r/min离心2min～5 min,红细胞沉聚,取出吸附过的血清供检。2.8器材架盘天平、分析天平、离心机、V型微量血凝板、微型振荡器、可调移液器、恒温箱等。3操作方法3. 1 微量血凝试验微量血凝试验见表 1。表 1禽流感微量血凝试验孔号635724891011112抗原滴度（log2）235146891011对照PBS/μL.25 225 7257257.25725725252572572572525J25J25抗原倍比稀释/μL25J25J25J25J25J25J25J25J弃杰25PBS/μL25252525252525 252525251251%鸡红细胞/μL252525252525o2525252525作用时间及温度室温（约20℃）下静置40min左右判定举例+++++++++++++++++++++++++++++++++++1 SN/T 1182.2—20043.1.1在V型微量血凝板上，每孔加人 PBS 25μL。3.1.2孔1加禽流感标准抗原25μL，反复吹打充分混匀，移出25μL至孔2；吹打混勾，移出25μL至孔3，依次类推作等量倍比稀释至孔11,孔11弃去25μuL。孔12不加抗原设立为红细胞对照。3.1.3每孔加人 PBS 25 μL。3.1.4每孔加人1%鸡红细胞悬浮液25uL，立即置微型振荡器上振荡或手持血凝板绕圆圈混匀。3.1.5室温（约20℃）下静置 40 min左右；如果室温太高，可在4℃静置约60 min。对照红细胞呈明显的圆点状时进行抗原效价判定。完全血凝的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，即一个血凝单位(HAU).3.1.64HAU抗原的标定根据3.1.5测定的抗原的血凝效价，计算4HAU抗原的稀释倍数。例如表1抗原效价为2°（1：128），其4个单位抗原效价为25（1：32），则将抗原稀释32倍。将25 μL含4HAU的抗原用PBS做等量倍比稀释,使每孔（25 μL)含有 2 HAU、1 HAU0.5HAU、0.25 HAU,每孔补加PBS25 μL,再加人1%鸡红细胞25uL，判定血凝图像与预期结果是否相符。2HAU、1HAU孔红细胞应出现完全凝集，0.5HAU孔红细胞应出现50%凝集，0.25HAU孔红细胞应不凝集。若与此不符，应重新配制抗原，测定效价。3.2微量血凝抑制试验微量血凝抑制试验见表2。表 2 禽流感微量血凝抑制试验孔号12310111247895b血清稀释度(logz)29101112234586LPBS/μL2572572572572572525725725725~25725°