SN_T 4822-2017牛尿苷酸合酶缺乏症荧光定量PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4822--2017牛尿苷酸合酶缺乏症荧光定量PCR检测方法Detection method of deficiency of uridine monophosphate synthase by RT-PCR2017-07-21发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局涂层查真伪 SN/T 4822—2017前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李红权、孙良娟、张娜、刘中勇、谢艳辉、吴晓薇、李家侨、周广彪、朱事康、朱道中、马保华、刘志玲、林志雄、鱼海琼。 SN/T 4822--2017牛尿苷酸合酶缺乏症荧光定量PCR检测方法1范围本标准规定了牛尿苷酸合酶缺乏症荧光定量PCR检测的操作方法。本标准适用于牛尿苷酸合酶缺乏症(参见附录 A)的监测、诊断和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cycle threshold)DUMPS尿苷酸合酶缺乏症(deficiency of uridine monophos phate synthase)RT-PCR实时荧光定量 PCR(realtime fluorescence quantitative PCR)SNP单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)4试剂和与材料4.1 苯酚(C.H.O)。4.2三氯甲烷(CHCl;）。4.3异戊醇L(CH:)2CHCH²CH,OH]。4.4苯酚-三氯甲烷-异戊醇：饱和过的重蒸酚：三氯甲烷：异戊醇按25：24：1的比例混合。4.5蛋白酶K裂解液（10 mg/mlL）:将 100 mg 蛋白酶K溶解于 10 mL.灭菌蒸馏水中，保存在-20 ℃待用,避免反复冻融。4.6SDS溶液：用900mL水溶解200g电泳级SDS,加热至68℃助溶，加浓盐酸调节pH值至7.2,加水定容到1 000 mL,室温保存。4.7DNA提取纯化试剂盒。4.8荧光定量PCR试剂盒（Realtime PCR Master Mix），购于试剂公司或其他等效试剂盒。4.9 灭菌 ddH²O。4.10引物和探针（浓度均为10μmol/L）。Fl: 5-ttctgaatttgtgattggtttat-3R1:5-cctcctgcttctaactgaactc-3probe-W :5-VIC-ctggctcCgagtaagca-BHQ-3probe-M:5-FAM-ctggctcTgagtaagca-BHQ-31 SN/T 4822—20175仪器与设备5.13荧光定量 PCR仪。5.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。5.3普通台式离心机(离心速度3000 r/min）。5.4 1.5 mL Eppendorf 管。5.5 微量移液器(0.5 μL～10 μL、5 μL～20 μL、0 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL)。5.6肝素钠抗凝管。5.7生物安全柜。5.8冰箱：4℃±1℃，20℃±2℃。6操作方法6.1样品采集和基因组的提取6.1.1血液采集采用5mL真空肝素钠抗凝管，采集到血液后摇勾，使血液和抗凝剂混合均匀，以防血凝块的形成。6.1.2质控设置阴性对照：以不含DUMPS基因的正常牛血样本DNA模板为阴性对照。阳性对照：以含有目的基因序列的牛血 DNA为 PCR反应的模板，或采用含有目的基因的质粒为阳性对照。空白对照：包含除了测试样品DNA模板以外所有的反应试剂，在PCR反应体系中用相同体积的灭菌 ddH2O代替模板DNA。6.2DNA模板的提取6.2.1酚-三氯甲烷-异戊醇法取采集的血液100μL，加人400μL的0.01mol/L的PBS（见附录B)，然后加入蛋白酶K至终浓度100ug/mL和20%SDS至终浓度10g/L55℃水浴2h，用苯酚、苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（体积比为25：24：1）、三氯甲烷各抽提1次，吸取上层水相，加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻混匀后置一20℃沉淀1h，4℃条件下12000r/min离心15min，弃掉上清液，沉淀挥干后溶解于灭菌ddH²O中，4 ℃保存备用。6.2.2等效核酸提取法市场提供的符合相应质量要求的试剂盒和仪器以及配套的试剂均可用于本标准中样