微量海人藻酸刺激大鼠延髓网状背侧亚核后脊髓和三叉神经脊….doc

微量海人藻酸刺激大鼠延髓网状背侧亚核后脊髓和三叉神经脊 … 微量海人藻酸刺激大鼠延髓网状背侧亚核 后脊髓和三叉神经脊 … 第29卷第3期 1998年7月 解剖 ACTAANAT0MICASINICA Vo1.29.No.3 July1998 卯一2,捆 微量海入藻酸刺激大鼠延髓网状背侧亚核后脊髓 和三叉神经脊束核尾侧亚核内c一的表达* ,/. 逮.,奎云.施际武弓3 (第四军医大学解剖学教研室梁铼琚脑研究中心,西安710032; **南通医学院神经生物学研究室,南通226001) 摘要为了观察起自延髓网状背侧亚核(SRD)的下行投射对脊髓和三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc) 神经元活动的影响,将微量海人藻酸注入大鼠SRD中,致SRD神经元兴奋,在SRD下行通路的作用部位 引起c—los的表达.实验结果表明,在注射后30min,脊髓灰质内出现 Fos阳性神经元,1.5,2h时达高峰, 4h后明显减少.在高峰期,同一脊髓节段的不同板层内Fos阳性神经元的密度不同:I,i层gt;I,IV层gt; V,Xi,X层,?,IX层中偶见.Vc内Fos阳性神经元的出现时间和分布与脊髓后角相似.上述结果提示, 大鼠 reticularisdorsalis,SRD)是参与 “弥散型伤害性抑制调控”(diffusenoxiousinhibitorycontrols,DNIC)的重要核团Ll].形态学研究 结果也表明,在SRD与脊髓之间存在着往返纤维联系构成的神经环路,并且认为这种环路是 DNIC调控的结构基础[3].然而伤害性信息的调控较复杂,常常涉及到多级神经元的多突触联系, 但目前常用的示踪剂很难跨突触转运,只能反应某核团的一级联系,要完整地显示一条神经通路需 多次追踪才能完成,而且还不能直接说明其功能上的联系,1987年Morgan[6等创立了c—los原癌 基因表达法,在神经科学领域已被广泛的应用,包括用于检测外周受伤害性刺激激活的中枢多极神 经元功能通路.最近也有用微量海人藻酸注入大鼠中缝大核导致脊髓神经元c—los表达的报道[7]. 为了观察SRD在功能上与脊髓和Vc中的哪些板层的核团发生联系, 本研究将微量海人藻酸注入 SRD,使SRD神经元发生兴奋,经过一定时间后,观察脊髓和Vc中Fos阳性神经元的分布. 材料和方法 雄性SD大鼠16只,体重200~300g,分为实验组(n=14)和对照组(n一4). 1.实验组 1.1动物准备:将动物置于温暖,安静,避强光的环境下饲养1周,使之完全适应周围环境,以维 持良好的基础状态. 1.2手术过程:先用乙醚诱导麻醉,然后肌注Ketamine(0.5ml/只)维持麻醉,手术暴露闩平面 以下的延髓,直视下用微玻管将生理盐水配制的0.1I海人藻酸(20t*mol/L,其中加少量台盼蓝) 注入一侧SRD.手术过程在10min内完成,术后将动手放回术前相同的环境中,动物在术后3, 5min清醒,分别存活30min(n:2),lh(n一2),1.5h(n=6),2h(n:2),4h(n=2). 这期间注意观察 动物的状态和行为变化. 1.3材料制备:各组实验动物成活至预定的成活期,用戊巴比妥钠深麻,开胸,经升主动脉依次 灌注生理盐水100~150ml及含4多聚甲醛和0.2%苦味酸的 0.1mol/LPB(pH7.4)500ml,灌毕 立即取延髓和脊髓的代表性节段(c,,T,,L.,及S,)并浸入30蔗糖(0.1mol/LPB配制)中 *国家自然科学基金资助课题(No ? 解剖29卷 过夜(4?),冠状冻切,片厚3Om,隔4片取1,取3组收集于0.01mol/LPBS内. 1.4Fos免疫组织化学染色:第1,2组切片分别入(1)羊抗Fos血清(CambridgeResBio Chiemical,UK,1:14000),用含0.2TritonX一100的PBS稀释,室温下孵育1h后移入冰箱 (4?)中孵育48h;(2)生物素结合的兔抗羊IgG(Vector,1:200,PBS稀释),室温下孵育4h;(3)A— vidin—HRP(Vector,1:300,PBS稀释)室温下孵育2h.以上各步骤之间均用PBS漂洗3次,每次 5min,最后按GOD—DAB—Ni法呈色,反应时间为20~25min.将第1组切片裱片,晾干,脱水,透明, DPX封片,Olympus显微镜观察并摄片.为了分析Fos阳性神经元与初级传入C纤维终末的关系, 将第2组切片在完成上述染色后,置入 BSI—B(BandeiraeaSimplicifoliaIsolectin—B)-HRP(1: 8000,Sigma),室温下