NY_T 3307-2018动物毛纤维源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法.pdf

ICS 59.140.20X 45NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3307—2018动物毛纤维源性成分鉴定实时荧光定性PCR法Identification of animal-derived materials in wool fibers-Qualitative realtime PCR method2018-12-19 发布2019-06-01实施中华人民共和国农业农村部‧发布 NY/T 3307—2018前創言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心本标准主要起草人：张全芳、刘艳艳、范阳阳、胡悦、马德源、王俊燕、李燕、杨雪、谭晴晴、陈雪燕、刘国霞、步迅、王兴军。I NY/T 3307—2018动物毛纤维源性成分鉴定实时荧光定性PCR法1范围本标准规定了对水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维源性成分进行鉴定的实时荧光定性PCR法。本标准适用于动物毛纤维中水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种源性成分的定性检测。本方法检出限为1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1实时荧光 PCR qualitative real time PCR在PCR反应体系中加人荧光基因，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3. 2Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物源性成分。5试剂或材料除另有规定外，仅使用分析纯试剂。5.1 水,GB/T 6682,-级。5.21mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓HCl调节pH至6.4，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。5.31mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓HCl调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。5.40.5mol/LEDTA（pH8.0)溶液：称取18.61gNazEDTA·2HzO置于100mL烧杯中，加人80mL水，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。1 NY/T3307—20185.510%十二烷基硫酸钠（SDS)溶液：称取10gSDS溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL。储存于灭菌过的容器中待用。5.65mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。5.7 细胞裂解液(Lysis Buffer):取 1 mol/ L Tris-HCl(pH 8. 0)溶液 20 mL,0.5 mol/ L EDTA(pH8.0）溶液5mL，5.0mol/LNaCl溶液10mL，10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL，混匀。5.820mg/mL蛋白酶K溶液：准确称量0.2g蛋白酶冻干品，加无菌水溶解，加水定容至10mL,分装后于一20℃保存。5.9RNA酶溶液：将1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。5.101mol/L二硫苏糖醇(DTT)：准确称量1.543gDTT,加人6mL水溶解，加水定容至10mL,分装后于一20℃保存。5.115%Chelex-100树脂：称取5gChelex-100树脂，溶解于100mL水中。5.12硅珠悬浮液：取5g的硅胶加人到20mL的水中充分混合，静止24h，弃掉上清液，然后再加人20mL的水中充分混合，再静止5h，弃掉上清液。在沉淀的硅珠中加人5mL的水，再加入5μL的浓盐酸，充分混合，调节pH至2.0。5.13DNA结合液(Binding