SN_T 4067-2014进出境猴麻诊病毒病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4067—2014进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for measles to entry-exit monkey2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、刮涂墨查真优 SN/T 4067--2014前言本标准按照GB/T 1.1-一2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李丹丹、徐义刚、艾军、季新成、徐维加、林志雄、吴山楠、黄纪徽1 SN/T 4067--2014进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范1范围本标准规定了猴麻疹病毒的病原分离、病毒中和试验、实时荧光定量 PCR 试验、阻断 ELISA抗体试验的技术要求。本标准适用于进出境猴麻疹病毒的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T 2025动物检疫实验室生物安全操作规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。B95a细胞：绒猴淋巴母细胞CPE:致细胞病变作用（cytopathic effect)Ct值：荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数（cycle threshold）ELISA：酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay)MV:麻疹病毒(measles virus)TCIDso：半数组织培养感染量（tissue culture infective dose）4初步诊断该病的介绍参见A.1,可根据临床诊断和病理变化进行初步诊断，参见A.2、A.3,确诊还需实验室诊断。5 病毒分离5.1设备和器材倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、冰箱（－20℃，一70℃）、50 μL、100 μL微量可调移液器、无菌96孔细胞培养板、无菌塑料滴头、无菌塑料离心管（1.5mL）或5mL～10mIL无菌玻璃试管、无菌棉拭子。5.2试剂和材料5.2.1病毒：MV病毒标准毒株。实验环境和防护要求见 GB19489。1 SN/T 4067—20145.2.2血清:MV标准阳性血清、阴性血清。5.2.3被检样品：病猴呼吸道或血液采集标本。若需要长途运输，应将病料置于含有高浓度抗生素运输液中（每毫升5000IU青霉素，5000μg链霉素和10μg两性霉素B）。5.2.4细胞：原代人胚肾细胞或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞，一般不超过四代，按常规胰酶消化方法制备。5.2.5培养液：199培养液、生长液中加10%胎牛血清，维持液中加3%（或无）胎牛血清，含青霉素200 IU/mL、链霉素 200 μg/mL。5.2.6细胞分散液：0.25%胰蛋白酶。5.3样品采集宜在皮疹出现前，柯氏斑出现时采集样品。将灭菌棉棒稍蘸液体（2%牛血清Eagle液），反复涂抹病猴咽部数次，然后将棉棒浸于放人 2 mL含有高浓度青霉素和链霉素的无钙镁 PBS液中（1 mL～1.5 mL)反复挤压。加肝素抗凝的血液白细胞中也可分离病毒。5.4病毒培养取0.1mL～0.2mL样品液接种于生长在试管中的单层原代人胚肾细胞（或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞）上，37℃1h后弃液，再加人含双倍常规抗生素量的细胞维持液1 mL，37℃培养。开设未接种样品的空白对照培养。逐日观察,待80%～90%细胞出现病变时收获病毒悬液冻融或超声波处理后，3000 r/min 10 min，取上清液，分装小瓶，置一70℃保存备用。若未见病变需连续盲传三代，每次培养观察2周，如仍不出现病变则为阴性。6病毒中和试验6.1 病毒繁殖收获B95a细胞上出现 CPE的病毒悬液，复传一代，待 CPE达85%以上，收获病毒培养物冻融1次，3000 r/min10 min，取上清，分装置一70℃保存备用。6.2病毒毒力测定制备的病毒抗原或购进的标准病毒抗原，用维持液将其作10倍递增稀释至10-8，每一梯度病毒稀释液接种细胞培养板八孔，每孔50μL。随后每孔加入细胞悬液（3×105个细胞/mL）100μL和细胞培养液50μL。同时，每板设8孔细胞对照。置37℃二氧化碳培养箱培养，从24 h～168h逐日观察细胞病变，按Karber方法计算培养细胞半数感染量（