SN_T 1161-2010鹿流行性出血病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1161—2010代替SN/T1161—2002鹿流行性出血病检疫技术规范Quarantine protocol for epizootic haemorrhagic disease of deer2011-05-01实施2010-11-01 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数防 SN/T 1161—2010前 言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T 1161-2002《鹿流行性出血病琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与SN/T1161—2002相比，主要的技术性差异如下：增加了病原的分离及鉴定；-增加了病毒中和试验;增加了荧光抗体试验；增加了反转录聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨晶焰、严树发、陈兵、艾军、华玉卓、叶玲玲、阮周曦、尹尚莲、董俊、周晓黎。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1161--2002。 SN/T 1161—2010鹿流行性出血病检疫技术规范范围1本标准规定了鹿流行性出血病的病原分离及鉴定、病毒中和试验、荧光抗体试验、聚合酶链式反应和琼脂凝胶免疫扩散试验检测方法。本标准适用于鹿流行性出血病的诊断和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088　出人境动物检疫采样。3疾病概述鹿流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease of deer,EHD)是由鹿流行性出血病病毒(EHDV)引起的一种病毒性传染病。主要感染白尾鹿、牛、野牛、羊等动物被感染后可视粘膜和浆膜出血，眼结膜和口腔粘膜暗红或紫蓝，有“蓝舌”样，粪和尿带血有时唾液也带血，体温呈复相升高，剧烈休克而死亡。该病为非接触性传染病，库螺可以带毒,并传播本病。其病原、流行病学、临床症状、病理变化、检疫及诊断、防制参见附录 A。4现场检验检疫及采样4.1现场检验检疫：逐头进行临床检查，根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。4.2采样：按GB/T18088的规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。5缩略语下列缩略语适用于本文件。AMV-RT:鸟成骨髓细胞白血病病毒的逆转录酶BHK-21（baby hamster kidney）:幼仓鼠肾细胞BLP:乳糖蛋白陈缓冲肉汤CPE（cytopathic effect）:细胞病变DEPC（diethyl pyrocarbonate):焦碳酸二乙酯EHDV（epizootic haemorrhagic disease of deer virus):鹿流行性出血病病毒RT-PCR:反转录聚合酶链式反应SPF:无特定病原体动物TCIDso:组织培养半数感染量Trizol:酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液 SN/T 1161--20106 病毒分离及鉴定6.1 病毒分离6.1.1 试剂与材料鹿胎肾细胞或幼仓鼠肾细胞(BHK-21):使用时配制成 3X105个/mL细胞悬液。EHDV 阳性血清和阴性血清:试验前血清需经 56℃灭能 30 min。10 日～～11 日龄 SPF鸡胚。细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS、BLP等，配方及配制方法见附录B。6.1.2设备倒置光学显微镜、荧光显微镜。二氧化碳培养箱。研钵或组织捣碎机、离心机。可调微量移液器。细胞培养瓶、细胞培养板等。照蛋灯、开孔器。6.1.3样品采集与处理血液样品采集与处理取肝素抗凝血 5 mL,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤血样 3次～4 次,每次 2 000 r/min 离心10 min，弃上清液后加入等量BLP,置冰浴中用超声波（40 uA、1 min)处理，经处理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一70℃保存备用。组织样品采集与处理无菌采集动物肾、脾、肝各5g,剪碎后加人乳糖蛋白陈缓冲肉汤(BLP)10mL(含青霉素 2 000 IU/mL、链霉素2000μg/mL），置乳钵中研磨，置4℃浸泡4h以上，取上清液5mL用超声波裂解（100μA、1min～2min)处理或冻融三次，3000 r/min离心20 min，取上清液使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一70℃保存备用。库螺样品采集与处理取 200个～300个库螺盛于小试管中，加人含青霉素 2 000 IU/mL、链霉素 2 000 μg/mL 的 BLP3mL～5 mL置冰浴中研磨虫体,3000 r/min离心20 min,取上清液使用,使用前置 4℃保存，剩