SNT 1899-2007大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1899--2007大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法Identification of Diaporthe phaseolorum (Cooke et Ell. ) Sacc. var.caulivora Athow et Caldwell and Diaporthe phaseolorum (Cooke et Ell. ) Sacc.var. meridionalis F. A. Fernandez2007-05-23发布2007-12-01实施中华人民共和国发布951052151国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1899-2007前言本标准的附录 A、附录 B和附录 C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准起草人：严进、吴品珊、顾建锋。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。·1 SN/T 1899--2007大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法1范围本标准确立了进境大豆[Glycine max（L.）Merrill7种子及其夹带的植物残体的大豆茎溃疡病菌检疫和鉴定方法。本标准适用于对来自大豆茎溃疡病发生国家和地区的所有用于加工和繁殖的大豆的进境检疫。2原理2.1分类地位英文名:Soybean Stem Canke学名：北方大豆茎溃疡病菌:Diaporthe phaseolorum （Cooke et Ell.） Sacc. var. caulivora Athow et Caldwell南方大豆茎溃疡病菌:Diaporthe phaseolorum (Cooke et Ell.） Sacc. var. meridionalis F. A. Femandez无性态：北方大豆茎溃疡病菌：Phomopsis phaseoli南方大豆茎溃疡病菌：Phomopsissp.大豆茎溃疡病菌属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），子囊菌纲（Ascomycetes），间座壳目（Diaporthales），黑腐皮壳科（Valsaceae),间座壳属（Diaporthe Nits.）。2.2鉴定原理北方茎溃疡病菌的种传几率比较高，平均12.5%,最高可达22%。南方茎溃疡病菌的种传几率较低,通常不会高于5%。病原菌以菌丝的形态存活于种子内。此外,病菌还可以菌丝和子囊壳的形态在大豆病残体上越冬，并随病残体作远距离传播。此真菌为兼性寄生菌。因此，本标准采用的原理是从带菌种子和病残体上分离病原菌,并根据病原菌的形态进行鉴定3仪器和用具3.1仪器体视显微镜、普通光学显微镜（具油镜和测微尺）、普通天平（感量0.1g）、洁净工作台、光照培养箱或光照培养架、紫外光灯管（根据培养箱或培养架尺寸）高压灭菌器。3.2　用具滤纸、手持放大镜、培养皿、烧杯、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。4 试剂和培养基4.1试剂马铃薯、葡萄糖、琼脂、25%乳酸、1.25%次氯酸钠（NaC1O)、无菌水、75%酒精。4.2培养基马铃薯葡萄糖培养基(PDA)。5鉴定方法5.1 症状检查茎溃疡病菌在植株各个生长阶段都能侵染。受侵染的茎组织在溃疡部位易碎，表皮剥落,形成环形 SN/T 1899-—2007带。受侵染的种子皱缩、变轻，外表白垩状。观察收集的大豆种子及夹杂的植物残体有无上面所描述的症状。疑似的病残体和病子粒要带回实验室进行显微镜检验和病原菌分离。5.2保湿培养5.2.1种子保湿培养每份样品取400粒种子，用1.25%的次氯酸钠表面灭菌3min～4min后，放在垫三层灭菌湿滤纸的培养皿中，每血10粒，在室温20℃～22℃下放置24h后，在一20℃下冷冻24h，然后转至25℃光照培养箱或光照培养架上培养，黑暗和近紫外光照各12h交替，10d后观察种子上是否出现白色菌丝。5.2.2植物残体保湿培养植物残体在75%的酒精溶液中浸泡1min，经灭菌水洗涤后放置在垫三层湿润滤纸的培养皿中，转至25℃光照培养箱或光照培养架上培养，黑暗和近紫外光照各12h交替，10d后观察植物残体表面是否出现白色菌丝。5.3　分离挑取少量白色菌丝转到酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA）（PDA培养基在灭菌后倒平皿前，用25%乳酸将pH调至4.5）上，近紫外光照和黑暗各12h交替，25℃下培养40d。观察菌落特征，如菌落中有黑色子座，则用针挑取子座，用水作浮载剂制成玻片，在显微镜下观察有性繁殖器官，如子囊壳、子囊、子囊孢子等。5.4　生物学鉴定观察菌落特征，如菌落中有黑色子座，则用针挑取子座，用水作浮载剂制成玻片，在显微镜下观察有性繁殖器官，如子囊壳、子囊、子囊孢子等。6鉴定特征北方茎溃疡病菌的菌落白色，致密，菌丝丛生，从培养基背面观