SN_T 4748-2017淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4748—2017淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范Quarantine protocol for lymphocytic choriomeningitis2017-05-12 发布2017-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4748--2017前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张强、王艳、杨春华、熊炜、林颖、李树清、王巧全、朱事康、李健。 SN/T 4748--2017淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范1范围本标准规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光RT-PCR和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术规范。本标准适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489　实验室‧生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。BSA:Ⅲ清白蛋白(Bovine serum albumin)ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay)HRP:辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)LCMV:淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)4初步诊断参照附录A疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断，进一步应采集样品进行实验室检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求进行。53实验室诊断5.1荧光定量 RT-PCR 试验5.1.1试剂 TRIZOL.三氯甲烷。异丙醇：一20℃预冷。 0.1%DEPC 水。 75%乙醇。RNA 酶抑制剂（40 U/μL）。 SN/T 4748—20Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)及相应 10X缓冲液。M-MLV反转录酶(200 U/μuL)及相应 5×反转录反应缓冲液。dNTPs(2.5 mmol/L)。0MgCl2(25 mmol/L)5.1.2设备二级生物安全柜。高压灭菌锅。微量移液器。7高速冷冻离心机。荧光PCR仪。5.1.3，引物和探针引物和探针针对LCMV基因组NP片段序列设计，由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC溶解至10 μmol/L后，保存于20℃备用。引物、探针的名称、序列及位置见附录B的表B.1。5.1.4质控物质阳性对照将LCMV基因NP片段克隆人质粒载体，提取质粒，并将其线性化，线性化时保证NP片段完整，经体外转录后制备成cRNA溶液，用做阳性对照。阴性对照LCMV阴性小鼠组织，经匀浆后，1 000 g 离心5 min,取上清用做阴性对照。5.1.5样品的采集制备处死受检动物，采集脑、脏器组织作为检测样本。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。用无菌剪刀和镊子剪取待检样品于研磨器中充分研磨，再加人5倍体积的PBS混勾，然后将组织悬液转人无菌Eppendorf 管中，编号备用。5.1.6存放与运送采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h;若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。5.1.7样品核酸的提取取 n 个1.5 ml.灭菌Eppendorf 管,其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。每管加入600uL裂解液，然后分别加人待测样品、阴性对照和阳性对照各200uL，一份样品换用一个吸头；再加人200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000g离心15min。取与中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），对每个管进行编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。2 SN/T 4748—20于4℃条件下，12000g离心15min。轻轻倒去上清液倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人600ul75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000g离心10min。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。4000g离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3m