NY_T 2466-2013大麦品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.20B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2466-2013大麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法Identification of barley varieties--SSR marker method2013-12-13 发布2014-04-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2466--2013目次前育-范围2规范性引用文件3原理仪器设备及试剂45溶液配制6引物·7参照品种及其使用.8操作程序...9等位变异数据采集，10判定标准…附录A（规范性附录）仪器设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配制附录C(规范性附录)核心引物·附录 D(资料性附录)参照品种名单13 NY/T 2466-2013前言本标准按照（GB/T1.1-2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：王艳平、沈奇、堵苑苑、张继红、李华勇、王显生、吴燕、戴剑。I NY/T 2466-2013大麦品种鉴定技术规程星SSR分子标记法1 范围本标准规定『利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记进行大麦（HordeumvulgareI）品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于大麦DNA分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程托样GB/T19557.1植物新品种特异性、-致性和稳定性测试指南总则NY/T2224一2012植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南大麦3原理SSR广泛分布于大麦基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。由于每个SSR位点两侧的序列是高度保守和单拷贝的.因而可根据其两侧的序列设计-·对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程中，主要由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性.利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大麦品种。4仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。5溶液配制溶液配制方法见附录B。6引物引物相关信息见附录C。7#参照品种及其使用参照品种的名称见附录C，参照品种的来源参见附录D。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。注1：多个品种在某··SSR位点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录D中的参照品种使用。注2：同一-名称不同来源的参照品种的某--位点.上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时.应与原参照品种核对，确认无误后使用。注3：对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和对应参照品种。8操作程序8. 1样品准备1 NY/T 2466--20138.1.1分析和保存种子样品的分样和保存.应符合GB3/T3543.2的规定。8.1.2分析每份样品检测10个个体（种子、叶片或其他器官组织），混合分析。对致性差的样品每个个体单独分析。8.2DNA提取取大麦的幼苗或叶片0.5g，剪碎，放人2ml.离心管中。往离心管中加人液氮，放入研磨仪，磨成粉状后立即加人预热的DNA提取液800L左右，剧烈摇动混匀，并在65℃水浴中保温30min50min其间可摇动几次。冷却至室温加入等体积三氯甲烷-·异皮醇（24：1）.颠倒混匀.室温下静置5min～1Cmin，使水相和有机相分层。12000g离心10min。移取.l清液至另·个2mL离心管中，加人约1.5倍体积的预冷乙醇.轻缓颠倒混匀.经12000g离心3min至分相，弃上清液。用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加人50μL1×TE缓冲液溶解沉淀。用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/μl。置于一20℃保存备用。注：其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。8.3PCR扩增8.3.1反应体系25ul的反应体积（或12.5μL）.含dNTPs2.5mmol/L.正向引物10umol/L，反向引物10μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0单位,10XPCR Buffer(含 Mg²°）.样品 DNA20ng。利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记的引物。引物的荧光染料种类见附录（。注：反