SN_T 3433-2012橡胶白根病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3433—2012橡胶自根病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Rigidoporus lignosus (Klotzsch) Imaz.2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准橡胶白根病菌检疫鉴定方法SN/T3433—2012*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张1字数26千字2013年6月第一版2013年6月第一次印刷印数1-1600*书号：155066·2-25283：定价21.00元 SN/T 3433—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局。本标准参加起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：韩玉春、刘福秀、李伟东、徐卫、林明光、赵立荣、闻伟刚。 SN/T3433—2012橡胶自根病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了出人境植物检疫中橡胶白根病菌Rigidoporuslignosus（Klotzsch）Imaz.的检疫鉴定方法。本标准适用于橡胶属Hevea等植物种苗及其他繁殖材料上橡胶白根病菌的检疫鉴定。2原理学名：Rigidoporus lignosus(Klotzsch）Imaz异名:Fomes lignosus(Klotzsch)Bres.Rigidoporus microporus (Fr.)OvereemPolyporus lignosus Klotzsch橡胶白根病菌Rigidoporuslignosus（Klotzsch）Imaz，属于真菌界Fungi，担子菌门Basidiomycota，担子菌纲Basidiomycetes，无隔担子菌亚纲Holobasidiomycetidae，非褶菌目Aphyllophorales，薄孔菌科Meripilaceae，硬孔菌属Rigidoporus真菌。橡胶白根病菌属根部专性寄居菌，主要寄生橡胶属植物的根部，离开寄主组织在土壤中不能存活。该病菌在侵染植物的过程中能产生粗细不一的根状菌索，天气潮湿时在病变根部长出子实体。该病菌主要通过根系接触，借根状菌索蔓延而传播，也能借子实体产生的担孢子经过气传沉降到树桩切面或根系伤口形成新的侵染源，再经过根系接触传播。该病菌的为害症状、形态特征、培养性状、致病性测定及分子生物学信息是鉴定橡胶白根病菌的依据。详细资料参见附录A和附录B。3试剂与培养基3.1试剂燕麦片、琼脂粉、蔗糖。三烃甲基氨基甲烷盐酸盐、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、蛋白酶K、冰醋酸、溴酚蓝、氯化钠、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、DNA相对分子质量Marker、溴化乙锭、次氯酸钠。10XPCR缓冲液、氯化镁、dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR引物、琼脂糖。3.2培养基病菌分离和纯化采用燕麦琼脂培养基（见附录C）。燕麦琼脂平板：将灭菌燕麦琼脂培养基熔化后倒人灭菌的培养皿中，形成2mm～3mm厚的平板。燕麦琼脂斜面：将2mL～4mL燕麦琼脂培养基装人试管中，灭菌后，立即将试管摆放在一定斜度的坡面上，凝固后制成斜面培养基。4仪器和用具4.1仪器PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超1 SN/T3433--2012低温冰箱、常规冰箱、漩涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统、生物显微镜、生物培养箱、高压灭菌锅、电子天平等。4.2用具酒精灯、三角瓶、培养皿、试管、载玻片、盖玻片、接种针、接种环、移液器、手术刀、剪刀、镊子、玻璃棒等。5检疫与鉴定5.1症状观察仔细观察橡胶树种苗根部，有无典型或可疑症状，症状描述参见附录A。5.2样品抽取发现可疑植株，切取感病部位组织，或将整株可疑植株带回实验室作进一步检测。6鉴定方法6.1病菌形态鉴定6.1.1组织保湿观察用塑料盒作为培养器皿，在盒内铺上保湿滤纸。將采集可疑病根组织样品置于滤纸上，无菌水喷雾保持病根组织高度湿润，置培养箱内在28℃土℃黑暗或弱光下培养，3d后观察病根有无菌索产生。若有菌索产生，则进一步采用培养基法进行病菌分离纯化培养。6.1.2病菌分离培养剪取可疑的病变植物组织先用清水洗干静，用0.5%次氯酸钠溶液表面消毒5min，灭菌水洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，