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第 第 PAGE 1 页 共 NUMPAGES 1 页 「毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选」 　毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选  菌体的准备:　  1. 挑取酵母单菌落,接种至含有５ml YPＤ　培养基的50ml 三角瓶中，30℃、２50－300r／min培养过夜;　  2． 取100-5０0μl　(≤1:100)的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200ｍＬ三角摇瓶中，28~30℃、250-30０r/ｍｉn培养过夜 (约2０h),至ＯＤ60０　达到１.3~1.5;　  3． 将细胞培养物于４℃，1500g 离心５miｎ,用50ml　的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；　  ４. 按步骤3 离心,用２5ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬  ５． 按步骤3 离心,用２-5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；  ６. 按步骤３ 离心，用１60μl的冰预冷的1moｌ的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul;  工作态度和责任心总结 备注：可将其分装为８0 μl 一份的包装-70冷冻起来，２周之内使用,但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9Ｋ的载体转GＳ115一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G４１８抗性的YPＤ平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶ＢMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。  ?KM71冬瓜糖的做法比GＳ11５生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的  ?对于LＯX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入 Ｃｕ2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?  菌种保存:  挑单克隆到YPD中培养1８-2４ｈ,然后取菌液以１:1加入30%灭菌甘油，　-8０ｏC 拯救我们的城市ul/管冻存   （一般用10ｕｇ以上质粒用ＳalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，７０%乙醇洗一遍,约20ul ｄdH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kｉt，回收的DＮA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。  乙醇沉淀主要步骤如下: 1）酶切体系(８０ul）中2倍体积的无水乙醇加1/1０体积的PH5.２ NaAC,混匀?２）-20℃ 20分钟沉淀?３)1３2０0rpm,２0min,离心后弃上清?4）７5%乙醇3０0uｌ轻轻洗,同上离心５ｍin，弃上清5)３７ 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。?6)20ul　ddH2O重溶）.rtcscls-2-p_0 { }.rtcscls-2-r_0 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-r_1 { font-size: 18px;font-weight: 700; }.rtcscls-2-r_12 { font-size: 18px;font-weight: 700; }.rtcscls-2-r_2 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-r_3 { font-size: 18px;font-weight: 700; }.rtcscls-2-r_5 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-s_p_1 { text-align: justify; }.rtcscls-2-s_p_13_rId_a5 { text-align: left; }.rtcscls-2-s_p_18_rId_a7 { }.rtcscls-2-s_p_21_rId_a8 { text-align: left; }.rtcscls-2-s_p_3_rId_a { text-align: justify; }.rtcscls-2-s_p_8_rId_a3 { border-bottom: 1px solid #000000;text-align: center; }.rtcscls-2-s_r_0 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-s_r_11_rId_a4 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-s_r_14_rId_a5 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-s_r_16_rId_a6 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-s_r_22_rId_a8 { font-size: 18px; }.rtcscls-2-s_r_24_rId_a9 { text-decoration: underline; }.rtcscl