SN_T 3954-2014国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR 检测方法Detection of nipah virus at frontier port by RT-PCR and real timefluorescence RT-PCR2014-11-01实施2014-04-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局崇梦 SN/T 3954--2014前#言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、深圳市计量质量检测研究院、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：莫秋华、李卫岗、谭华、史咏梅、胡科新、兰全学、林继灿、杨泽、赵俊华、陈肖萧。1 SN/T 3954-2014国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了国境口岸尼帕病毒 RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法检验的对象、检测方法及结果报告。本标准适用于国境口岸尼帕病毒的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全通用要求SN/T 1193基因检验实验室技术要求WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(原中华人民共和国卫生部)人间传染的病原微生物菌（毒)种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部）人间传染的病原微生物名录(原中华人民共和国卫生部，2006年)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1尼帕病毒Nipah virus;NiV尼巴病毒Nipah virus;Niv属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）亨德拉尼帕病毒属（Henipavirus），单股负链 RNA病毒，可引起一种新型烈性人畜共患传染性疾病一一尼帕病毒病(Nipah virus disease,NVD),严重威胁人类和猪、马等动物的健康。尼帕病毒感染人后的潜伏期为1周～3周,在人群中有人传人的可能，人的临床表现主要为严重的快速进行性脑炎，脑干功能失常(表现为高血压、心动过速）,死亡率高达40%～70%。不同患者发病的严重程度各异，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，特征症状是颈部和腹部肌肉痊挛，同时出现体温升高、头痛、嗜睡、呕吐、咳嗽、意识混乱，严重的昏迷、死亡。3.2逆转录聚合酶链反应 reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR将 RNA 的逆转录(RT)和 cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。本标准采用一一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。在一步法 RT-PCR 中，,首先以 RNA 为模板,利用下游特异性引物，在依赖RNA的 DNA聚合酶(逆转录酶)的作用下转录合成互补 DNA（cDNA），该步称作逆转录”；随后,再以 cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物,在 DNA聚合酶的作用下进行 PCR循环扩增；最终使RNA分子的某个特定区域（目的片段)被扩增达几百万倍。1 SN/T 3954—20143.3实时荧光 RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后PCR扩增的产物进行标记跟踪，利用荧光信号累积实现实时在线监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。本标准所采用的荧光探针是 TaqMan 水解探针。该探针为-段寡核苷酸分子,在5’端和 3端分别标记荧光报告基团（如FAM)和荧光淬灭基团（如 TAMRA）。该探针可与 PCR产物发生特异性杂交。当探针保持完整时,淬灭基团抑制报告基团的荧光发射。在 PCR扩增时,利用 Taq 酶的 5’~→3外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，距离变大，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来并被仪器的荧光探测系统检测到。模板每复制一次，就有一条探针被切断，伴随一个荧光信号的释放，从而实现荧光信号的累积与PCR产物的数量完全同步。3.4Ct 值 cycle threshold在荧光PCR中,每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 缩略语4下列缩略语适用于本文件。4.1 DEPC:diethyl pyrocarbonate,焦碳酸乙二酯。4.2PAGE:polyacrylamide gel electrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳。4.3 HPLC