SN_T 3647-2013鲨鱼动物源性成分检测方法 PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3647—2013鲨鱼动物源性成分检测方法PCR 法Detection of shark derived material-PCR method2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局涂层查直 SN/T 3647—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局F本标准主要起草人：张舒亚、黄文胜、陈颖、祝长青、郭云霞、谌鸿超、吕蓉、李想、高琴、刘月明。I SN/T 3647—2013鲨鱼动物源性成分检测方法PCR 法1 范围本标准规定了原料及食品中鲨鱼动物源性成分的PCR鉴定方法。本标准适用于原料及食品（鲨鱼肝油等精加工产品除外）中鲨鱼动物源性成分的定性检测。该检测方法的检出限为0.1%。2#规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)Taq:水生栖热菌（Thermus aquaticu）OD：光密度值(optical density）4方法提要利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到 DNA；以提取的 DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用核苷酸序列测定进行确证。5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。5.2三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.3乙二胺四乙酸(EDTA)。5.4氯化钠(NaCl)。5.5三氯甲烷(氯仿）。 SN/T 3647—20135.6 异丙醇。5.7 无水乙醇。5.8 70%乙醇。5.9 裂解液:1%CTAB,0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0),0.7 mol/ NaCI,0.01 mol/I EDTA5.10 NaCl 溶液(1.2 mol/L)。5.11TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HCI（pH 8.0),1 mmol/L EDTA （pH 8.0)。5.12　分子量标准品（100 bp～2 000 bp）。5.13琼脂糖：电泳纯。5.14溴化乙锭。5. 15电泳缓冲液:Tris 54 g,硼酸27-5-g,0:5mot/I-EDTATris-TICl(pH8.0)20 mL,加蒸馏水至1 000 mI;使用时 10 倍稀释。加样缓冲液：0.25%溴酚蓝40%（质量浓度）蔗糖水溶液。5. 165.1710XPCR 缓冲液:200 mmol/1Tris-HCI(pH8. 4),200 mmot/L KCl,15 mmol/1 MgCl² 5. 18Taq DNA 聚合酶。5.19dNTP混合液。5.20检测用引物(对)序列：鲨鱼成分扩增引物、内参照（真核生物18SrRNA基因）引物详见表1。表 1 试验用引物名称序列(5°-3°)退火温度/℃内参照5端引物TCTGCCCTATCAACTTTGGATGGTA54内参照3端引物AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT鲨鱼5端引物CACCTTA AGGCAAACCAGCAC64GGGCAGGGTCGAATCTCT鲨鱼3端引物6仪器设备6.1PCR 仪。6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计6.3恒温水浴锅。6.4离心机：离心力12000g。6.5微量移液器(2.5 μL,10 μL,20 μl,100 μlL,200 μl,1 000 μI)。6.6研钵及粉碎装置。6.7涡旋振荡器。6.8 pH计。6.9电泳仪。6.10紫外检测仪。6. 11天平：感量0.01g。7试样选取与制备将实验样品粉碎，充分混合均匀后待用。2 SN/T 3647—20138检验步骤8.1