SN_T 4419.13-2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第13部分：葵花籽.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4419.13—2016出口食品常见过敏原LAMIP系列检测方法第13部分：葵花籽Food allergen detection with LAMP methods for export-Part13:Sunflower seed2016-03-09发布2016-10-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T4419.13—2016前言SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：第1部分：开心果；第2部分：腰果；第3部分：胡桃；第4部分：榛果；第5部分：杏仁；第6部分：扁桃仁；第7部分：巴西坚果；第8部分：澳洲坚果；第9部分：栗子；第10部分：大豆；第11部分：羽扇豆；第12部分：花生；第13部分：葵花籽；第14部分：芝麻；第15部分：大麦；第16部分：小麦；第17部分：荞麦；第18部分：芥末；第19部分：胡萝卜；第20部分：芹菜；第21部分：牛奶；第22部分：虾。本部分为SN/T4419的第13部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局，本部分主要起草人：凌莉、张隽、刘津、李婷、邓婷婷、陈颖、高东微、刘青、席静、关丽军、李志勇。 SN/T4419.13—2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第13部分：葵花籽1范围SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原葵花籽成分的环介导等温扩增（LAMP)检测方法。本部分适用于食品及其原料中过敏原葵花籽成分的定性检测本部分所规定方法的最低检测限（LOD）为0.5%（质量分数）2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文3.1.1过敏原allergen又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。3.1.2葵花籽sunflower seed葵花籽又名葵瓜子、葵子，是菊科向日葵属草才本植物向日葵Helianthusannuus的种子。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)LAMP：环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403一2008中附录D的规定。5方法提要样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用葵花籽HaG5基因特异性检测引物进行LAMP扩1 SN/T4419.13—2016增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原葵花籽成分。6LAMP检测方法6.1原理根据葵花籽HaG5基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的6个独立区域，在链置换型BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到dsDNA的小沟内。当它与dsDNA结合时，荧光信号是游离状态的800一1000倍。在不发生扩增反应时,SYBRGreenI染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着dsDNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表dsDNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2仪器和设备6.2.1水浴锅或加热模板：63℃±1℃和80℃±1℃。6.2.2离心管：0.1mL、1.5mL。6.2.3计时器。6.2.4移液枪：量程0.5μL~10μL、量程10μL~100μL、量程100μL~1000μL。6.3试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。CTAB提取缓冲液（20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/L6.3.2Na,EDTA,pH8.0)。6.3