DB34T 2999-2017动物尿液中FB 1 的测定—柱前衍生高效液相 色谱法.docxVIP

ICS 67.040 X 00 安 徽 省 地 DB34 方 标 准 DB 34/T 2999—2017 动物尿液中 FB1 的测定—柱前衍生高效液相 色谱法 Determination of FB1 in animal urine—High performance liquid chromatographic method with pre-column derivatization 文稿版次选择 2017 - 12 - 30 发布 2018 - 01 - 30 实施 安徽省质量技术监督局 发 布 I DB34/T 2999—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 安徽农业大学、安徽省农业科学院、阜阳市动物卫生监督所、安徽浩翔农牧有限 公司。 本标准起草人： 王希春、吴金节、汤继顺、谢玉洁、高亚飞、冯士彬、李玉、李锦春、李郁、孙裴。 1 DB34/T 2999—2017 动物尿液中 FB1 的测定-柱前衍生高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了动物尿液中 FB1 柱前衍生高效液相色谱法测定的原理、试剂和设备、分析步骤、分 析结果的表述、重复性、检出限与定量限、回收率。 本标准适用于动物尿液中 FB1 的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 样品经过离心处理， 取上清液过免疫亲和柱净化， 去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物 质。净化液中的 FB1 经过邻苯二甲醛衍生后进高效液相色谱柱分离，荧光检测，外标法定量。 4 试剂和设备 4.1 试剂 4.1.1 甲醇(CH3OH)：色谱纯。 4.1.2 乙酸(CH3COOH)。 4.1.3 氢氧化钾(KOH)。 4.1.4 氯化钠(NaCl)。 4.1.5 磷酸氢二钠(Na2HPO4 )。 4.1.6 磷酸二氢钾(KH2PO4 )。 4.1.7 硼酸(H3BO3 )。 4.1.8 2-巯基乙醇(C2H6OS)。 4.1.9 邻苯二甲醛(OPA，C8H6O2 )。 4.1.10 磷酸二氢钠(NaH2PO4 )。 4.2 设备 4.2.1 高效液相色谱仪，带荧光检测器。 4.2.2 振荡器。 4.2.3 微量进样器。 4.2.4 天平：感量 0.0001 g。 4.2.5 pH 计。 2 DB34/T 2999—2017 4.2.6 氮吹仪。 4.2.7 超低温冰箱。 4.2.8 离心机：转速 ≥4000 r/min。 4.2.9 免疫亲和柱(柱容量 ≥5000 ng，FB1 柱回收率 ≥80％)。 4.2.10 微孔滤膜：0.22 μm，有机型。 5 分析步骤 5.1 样品制备 取新鲜的或完全溶解的冻存尿液 5~10 mL，在 4000 r/m 离心 5 min，上清液转移至另一离心管 中。 5.2 试样净化 先用 10 mL PBS 缓冲液淋洗免疫亲和柱，自然流出，加入 5 mL 尿液上清液，再用 10 mL PBS 缓 冲液淋洗免疫亲和柱，然后用 1 mL 甲醇-乙酸溶液(附录A.1.4)洗脱免疫亲和柱三次，收集洗脱液， 55℃下氮吹至干，加入 500 μL 甲醇-水溶液(附录A.1.2)溶解残渣。涡旋 30 s，过 0.22 μm 微孔 滤膜后，收集于进样瓶中，待测。 注： 由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同，实际操作时，请参照厂商提供的操作说明和程序使用。 5.3 衍生 取 100 μL 标准溶液或样品溶液于进样瓶中， 加入 100 μL 衍生溶液(附录A.1.8) ，涡旋混合 30 s，在 2 min 内进样分析。 5.4 仪器参考条件 色谱柱：C18 柱，250 mm×4.6 mm， 5 μm 或相当者。 检测波长：激发波长 330 nm，发射波长 440 nm。 流动相：A： 磷酸二氢钠溶液(附录A.1.1)； B：甲醇。梯度洗脱，洗脱程序见表1。 流速：1.0 mL/min。 柱温：35℃。 进样量：100 μL。 表1 流动相洗脱程序 时间 min 流动相 A ％ 流动相 B ％ 0.00 35.0 65.0 13.00 20.0 80.0 5.5 试样溶液的测定 在 5.4 色谱条件下，将 100.0 μL FB1 标准工作溶液(附录A.2.2)按浓度从低到高依次注入高效 液相色谱仪；FB1 标准品色谱图参考附录B，待仪器条