NYT 1467-2007奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1467--2007奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术PCR for diagnosis of brucellosis in dairy cattle2008-03-01实施2007-12-18 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 1467-2007前言目前，我国家畜布鲁氏菌病的诊断主要方法包括虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、乳牛全乳环状试验等血清学方法(GB/T 18646-2002),没有列人病原诊断的内容。对牛布鲁氏菌病的诊断,OIE推荐或指定的血清学诊断方法包括血清凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA);病原诊断采用常规病原分离鉴定技术,并认为 PCR 方法的建立为该病的诊断提供了新的检测手段，可标准化后推广使用。本标准的附录 A为资料性附录,附录 B为规范性附录,附录 C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所本标准主要起草人：邱昌庆、曹小安、周继章。I NY/T 1467--2007奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术1范围本标准规定了检测牛种布鲁氏菌(B abortus)套式聚合酶链反应诊断方法要求。本标准适用于奶牛布鲁氏菌病的病原诊断、奶牛场检疫、疫情监测和流行病学调查。其他偶蹄动物布鲁氏菌病 PCR 诊断可参照本标准。2材料准备2.1器材:PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2mLPCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。2.2 试剂:NET缓冲液,自配,配方见附录 A;Rnase A 酶、蛋白酶 K、Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液、dNTPs、DL2000 DNA分子质量标准、无水乙醇、酚一氯仿一异戊醇(25：24：1）、Tris、琼脂糖、EDTA、冰乙酸、氯化钠、溴酚蓝、二甲基苯青FF、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙酸钠、盐酸、聚蔗糖。2.3 引物:Bp1 5- CGT GCC GCA ATT ACC CTC- 3′Bp2 5- CCG TCA GCT TGG CTT CGA - 3Bp3 5- GAT GCT GCC CGC CCG ATAA- 3Bp4 5- GCA CCG AGC GAG CCT TGA AA - 3引物在使用时用灭菌双蒸水稀释为 50 pmol/L。2.4被检材料：奶牛新鲜原乳、流产母牛乳汁、流产母牛阴道分泌物、血液（血清）、流产胎儿胃液、种公牛精液。布鲁氏菌病疑似病例病料采集和运输注意事项见附录 B。2.5布鲁氏菌总 DNA 的提取。2.5.1原乳乳样中布鲁氏菌总 DNA的提取方法。在室温下溶解冻存乳样(乳样长期保存应置于一20℃，当日检测可置于 4℃）,取 500μL奶样于2mL离心管中,加人100 μLNET缓冲液。加人 100 μL 20%的 SDS(终浓度 3.4%）,混匀。在 95℃～100℃孵育10 min后,迅速放置于冰上冷却 10 min～15 min。在样品中加人 Rnase A酶至终浓度为 75 μg/μL,50℃作用2 h。然后加人蛋白酶K至终浓度为 325 μg/μL,50℃作用 2 h。在消化液中加人等体积的酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)，颠倒2次～3次，摇匀,4℃下7 000 r/ min离心 10 min。移上清液于另一离心管中。重复、操作过程，加人2.5倍体积的预冷无水乙醇，一20℃沉淀30min，12000 r/min离心10 min,弃去所有液相。用1 mL70%乙醇漂洗,12 000 r/min离心2min,重复2次～3次。真空或室温干燥,DNA沉淀物用25μL无菌双蒸水溶解作为模板，保存在一20℃备用。2.5.2 血液中布鲁氏菌总 DNA 的提取。 血液分离血清。1 NY/T 1467--200布鲁氏菌总 DNA的提取方法同2.5.1。2.5.3胃液中布鲁氏菌总 DNA 的提取胃液中布鲁氏菌总 DNA的提取方法同 2.5.1。2.5.4流产母牛阴道分泌物中布鲁氏菌总 DNA 的提取用NET缓冲液2mL冲洗棉签蘸取的流产母牛阴道分泌物。牛阴道分泌物中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1。2.5.5流产胎衣中布鲁氏菌总 DNA 的提取取病变明显的一小块流产胎衣剪碎或刮下黏膜层,将碎组织块或黏膜层置于2mL离心管中，加人 400 μLNET裂解缓冲液(pH 7.6)。胎衣中布鲁氏菌总 DNA 的提取方法同 2.5.1。2.5.6公牛精液中布鲁氏菌总DNA的提取取 100μL精液,加人 500μL NET裂解缓冲液(pH 7.6)。公牛精液中布鲁氏菌总DNA的提