SN_T 1611-2013南方菜豆花叶病毒血清学检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1611—2013代替SN/T1611--2005南方菜豆花叶病毒血清学检测方法Serological detection methods of Southern bean mosaic virus2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准南方菜豆花叶病毒血清学检测方法SN/T 1611—2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16　印张0.75　字数18千字2014年4月第一版2014年4月第一次印刷印数 1—1 600*书号：155066·2-26945 SN/T 1611—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1611—2005《南方菜豆花叶病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1611--2005相比，主要技术变化如下：-增加了免疫电镜检测方法；增加了免疫捕获RT-PCR验证方法;增加了南方菜豆花叶病毒相关资料的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于翠、杨翠云、胡培龙、陶庭典、印丽萍。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1611—2005。I SN/T 1611--2013南方菜豆花叶病毒血清学检测方法1 范围本标准规定了植物检疫中南方菜豆花叶病毒基于血清学的DAS-ELISA、免疫电镜和免疫捕获RT-PCR 等检测方法。本标准适用于进出境豆科植物种子、苗木及传毒介体中南方菜豆花叶病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。-凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3南方菜豆花叶病毒基本信息中文名：南方菜豆花叶病毒异名：菜豆花叶病毒 4 号 Bean mosaic virus 4;南方菜豆花叶病毒1号 Southern bean mosaic virus 1;菜豆南方花叶病毒 Bean southern mosaic-virus。缩写:SBMV英文名:Southern bean mosaic,Mirus分类地位:南方菜豆花叶病毒属 Sobemovirus传播途径：病毒可能以循环型方式由叶甲传播。菜豆种传机率1%～5%，豇豆种传机率为5%～40%。实验中易于机械接种传播该病毒的其他相关资料参见附录 A。4　原理SBMV是直径约30nm的球状粒子，为有效的免疫源，可制备高效价的抗血清。在此基础上建立了DAS-ELISA和免疫电镜检测方法。病毒为单分体基因组，根据保守序列设计特异性引物，建立了免疫捕获 RT-PCR验证方法。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备PCR仪、酶标仪、洗板机、电子天平（感量1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、台式小型离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。5.2试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。南方菜豆花叶病毒血清学检测试剂盒、RNA反转 SN/T 1611-2013录酶、PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、Taq DNA 聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附录 B。6检测鉴定方法6.1样品制备6.1.1待测样品为小苗时，挑选有疑似症状的植物的不同部位研磨后加人抽提缓冲液，离心取上清待用。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样。抽样比例及方法见SN/T2122.症状描述参见附录 A。6.1.2待检测的样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小的种子研磨器打碎后加人样品抽提缓冲液，充分浸泡后离心取上清待用。6.2双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)6.1制备的上清液用于DAS-ELISA检测。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照（如种子或叶片)应尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录C。6.3免疫捕获 RT-PCR 检测(IC-RT-PCR)PCR管包被南方菜豆花叶病毒抗血清后，加人6.1制备的上清液，进行免疫捕获。IC-RT-PCR具体操作步骤见附录D。6.4免疫电镜检测按照SN/T1840中的方法进行电镜观察。如观察到直径为30nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。7结果判定7.1样品经DA