SNT 2342-2009苹果茎沟病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2342—-2009苹果茎沟病毒检疫鉴定方法Quarantine identification of apple stem grooving virus2009-07-07 发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局效码防 SN/T 2342--2009前言本标准的附录 B、附录 C和附录 D为规范性附录,附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局，中华人民共和国宁波出人境检验检疫局，中国检验检疫科学研究院，石河子大学，中华人民共和国北京出人境检验检疫局，中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郭立新、段维军、向本春、梁新苗、陈红运、陈文炳、邵碧英、邓丛良、刘洪义、朱水芳。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2342-2009苹果茎沟病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus)的检疫鉴定方法。本标准适用于苹果、梨等的苗木、其他繁殖材料中苹果茎沟病毒的检疫鉴定2 原理2.1学名与分类地位学名: Apple stem grooving virus缩写：ASGV分类地位：发形病毒属(Capillovirus)的代表种；尚未划分到特定的科。2.2传播方式参见附录 A。2.3抗原特性具有中等免疫原性，属内不同种病毒之间无血清学关系，与纤毛病毒属（Trichouirus)的苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus)粒子形态类似,但在血清学上不相关。2. 4 病毒基因组基因组为 6 496 nt 的正义单链 RNA,含有 2个 ORF,其中 ORF1 编码产生一个 241 kDa 的多聚蛋白，随后切割成一些功能产物，外壳蛋白（CP)在C端;ORF2编码产生一个 36 kDa 的移动蛋白（MP）。该病毒 MP 基因和 CP 基因相对保守,且 CP 基因的保守性更强。2.5鉴定依据根据苹果茎沟病毒具有中等免疫原性、可以制备病毒抗血清,CP基因保守性强、可以设计引物和探针等特点，双抗体夹心酶联免疫吸附反应、逆转录-聚合酶链式反应及实时荧光 RT-PCR反应可以作为检疫工作中检疫鉴定该病毒的依据。3试剂和溶液除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯。3.1酶联免疫检测试剂:见附录 B第 B.1 章。3.2 总 RNA 提取试剂:Trizol Reagent。3.3 RT-PCR 一步反应法试剂:Ready-to-Go RT-PCR Beads。3.4 三氯甲烷。3.5 异丙醇。3.6 75%乙醇。3.7无水乙醇。无 RNase水：经0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的双蒸水或商品无RNase水。3.83.9逆转录酶及其缓冲液。3.10核糖核酸酶抑制剂。3.11 dNTPs:含 dATP,dCTP,dGTP,dTTP。 SN/T 2342--20093.12氯化镁（MgCl²）。3.13DNA 聚合酶及其缓冲液。3.14琼脂糖：电泳纯。3.15溴化乙锭。3. 16 DNA Marker:100 bp～2 000 bp。3.17 50XTAE缓冲液:见 C.1.1。3.18上样缓冲液：见C.1.2。?仪器和材料4.1研钵。4.2电子天平（感量0.001g）、普普通天平（感量0.1g）。4.3冷冻离心机、小型瞬时离心机4.4常温冰箱、低温冰箱（一40°4.5超低温冰箱（-80℃）。4.6制冰机。4.7涡旋振荡器。4.8磁力搅拌器。4.9高压灭菌锅。4. 10pH计。4.11PCR 仪。4. 12实时荧光PCR仪。4.13微波炉。4.14电泳仪。4. 15电泳槽。4.16凝胶分析成像系统。4.17酶联检测仪。4. 18微量可调移液器：2μL、20200ml、1.000 μL.5 000*F4.19无RNase吸头:10 μL、20L:200μl1000μt、50d0 μL4..20无RNase离心管:1.5mL4.21PCR反应管:200 μL。5 检疫鉴定方法5.1双抗体夹心酶联免疫吸附反应按附录B中规定的试验方法进行试验。5.2普通 RT-PCR 检测每个反应体系设置两个平行反应。检测时以含有病毒目标片段的质粒或受苹果茎沟病毒侵染的昆诺藜叶片 RNA作为阳性对照,以未含该病毒的植物组织 RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。按附录C中规定的试验方法进行试验。5.3实时荧光 RT-PCR 检测每个反应体系设置两个平行反应。检测时以含有病毒目标片段的质粒或受苹果茎沟病毒侵染的昆诺藜叶片 RNA作为阳性对照，以未含该病毒的植物组织 RNA 作为阴性对照，以水代替模板