SN_T 3064.6-2011国境口岸蝇类、蜚蠊携带重要病原体检测方法 第6部分：霍乱弧菌.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3064.6---2011国境口岸蝇类、畵携带重要病原体检测方法　第6部分：霍乱弧菌Detections of important pathogens in flies and cockroachs at frontier port-Part 6 : Vibrio cholerae2012-04-01实施2011-09-09 发布中华人民共和国发布数码防伪，国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3064.6—2011言前 SN/T3064《国境口岸蝇类、董携带重要病原体检测方法》分为11部分：-第1部分：通用要求；第2部分：沙门氏菌；第3部分：志贺氏菌；-第4部分：致泻性大肠杆菌；-第5部分：普通变形杆菌和奇异变形杆菌；一第6部分：霍乱弧菌；1-第 7部分:副溶血性弧菌;一第8部分：金黄色葡萄球菌；一第9部分：蜡样芽孢杆菌；-第10部分：甲型肝炎病毒；-第11部分：寄生虫卵（包囊）。本部分为SN/T3064的第6部分。本部分按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：张海英、高旗利、张海滨、张霞、刘培、王洪亮。 SN/T 3064.6—2011国境口岸蝇类、畵携带重要病原体检测方法　第6部分：霍乱弧菌1范围SN/T3064的本部分规定了国境口岸输人性蝇类和蟹携带霍乱弧菌的检测方法、结果报告、阳性结果处置及血清学和生化分型(根据需要）本部分适用于检验检疫机构对输入性蝇类和携带霍乱弧菌的检测和报告。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.28食品卫生微生物学检验　染色法-培养基和试剂SN/T1022　出口食品中霍乱孤菌检验方法3样本检测3.1培养基和试剂实验所需培养基和试剂为科玛嘉弧菌显色培养基（CHROMagaiVibrio），赖氨酸试验用培养基，鸟氨酸试验用培养基,精氨酸试验用培养基,§NPG 培养基,硫代硫酸钠-柠檬酸钠-胆盐-蔗糖琼脂(TCBS),碱性蛋白陈水（APWI，T,N/琼脂,三糖铁琼脂（TSI)，改良纤维二糖多粘菌素B琼脂(mCPC),羊血琼脂，T,N。，T,N,T N,TiNid肉汤，蛋白陈水,冲葡萄糖蛋白陈水(VP试验用）,革兰氏染色液，氧化酶试剂，0.5%去算胆酸钠。真体成分及制备方法见SN/T1022。除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化纯，水为蒸馏水。3.2检测程序霍乱弧菌检测程序参见附录A。3.3操作步骤3.3.1增菌与分离分别取1mL样本处理液加人到100mLAPW中，将 APW放人温箱中，置于36℃土1℃，培养18 h～24 h。摇勾培养物，无菌操作，用接种环取一环菌液，四区法划线分别接种于表面干燥的 TCBS平板。建议同时接种科玛嘉弧菌显色平板，置36℃士1℃过夜培养。1）科玛嘉弧菌显色培养基(CHROMagarVibrio)是由法国博赛科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 SN/T 3064.6—2011霍乱弧菌在选择性培养基上特征：a）在 TCBS平板上的典型菌落为:黄色，直径为 2 mm～3 mm;b）在科玛嘉弧菌显色平板上的典型菌落为：蓝绿色，直径为1 mm～2 mm。3.3.2纯培养从 TCBS和科玛嘉孤菌显色平板上各挑取5个可疑菌落，划线接种TiNi平板培养基，置36℃土1℃,培养过夜,进行以下试验。3.3.3革兰氏染色具体操作步骤见GB/T4789.28。霍乱弧菌为革兰氏染色阴性，呈弧状或逗点状,不形成芽孢。3.3.4运动试验在载玻片上加1滴0.85%生理盐水，用接种针挑取新鲜纯培物与生理盐水混匀制成菌悬液。用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡，在油镜下观察菌体的运动性。霍乱弧菌一端有单鞭毛，运动活泼，呈穿梭状。3.3.5初步生化筛选用接种针接种纯培物做三糖铁试验、耐盐试验、粘丝试验和氧化酶试验。选取符合要求的纯培养物做进一步的生化确认。3.3.6生化确认按表1逐项进行生化试验；也可采用 API20E生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+鉴定卡进行确认。表 霍乱弧菌生化性状生化性状生化项目阳性氧化酶明显生长0%氯化钠胰陈水明显生长3%氯化钠胰陈水嗜盐性不生长7%氯化钠胰陈水初步生化筛选不生长10%氯化钠胰陈水产酸,变黄斜面产酸变黄，不产气三糖铁柱状底层阴性硫化氢阳性粘丝反应阳性鸟氨酸脱羧酶阳性赖氨酸脱羧酶阴性精氨酸双