SN_T 1674-2014锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1674-2014代替SN/T1674--2011锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for Koi herpersvirus disease2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1674—2014前‘言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1674--2011《锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范》。本标准与SN/T1674一2011相比，主要技术变化如下：对采样进行了细化；一删除了电镜观察；增加了临床症状；修改了细胞分离病毒的培养时间。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史秀杰、王津津、杨俊兴、孙明君、郭明星、何俊强、于力、贾鹏、郑晓聪、兰文升、刘。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1674—2005、SN/T1674-—2011。i SN/T 1674—2014锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范1范围本标准规定了锦鲤疱疹病毒病的临床诊断、病原分离、间接免疫荧光试验和聚合酶链式反应的检疫技术规范。本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的检疫或监测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T.18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3概述锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdisease，KHVD）是一种由疱疹病毒感染引起鲤鱼（Cyprinuscarpio)及其各品种如锦鲤等的传染性和急性病毒血症，病原为锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV)（参见附录A）。4试剂和材料4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。4.2KHV参考株：由指定单位提供。4.3细胞系：可选用KF-1(锦鲤鳍条细胞系)或CCB(鲤鱼脑细胞系）。用MEM培养液（见B.2)培养。4.4HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸。4.5KHV参考抗血清（单克隆抗体）：由指定单位提供。酶标二抗：FITC标记的羊抗鼠IgG，按照说明书使用。4.64.7引物基于检测KHVTK基因建立PCR方法的引物序列为：KHV TK-F:5-GGG TTA CCT GTA CGA G-3KHV TK-R:5-CAC CCA GTA GAT TAT GC-3扩增产物大小为410bp。基于检测KHVGraySph基因建立PCR方法的引物序列为：KHV SphI-5F:5-GAC ACC ACA TCT GCA AGG AG-3KHVSphI-5R:5-GAC ACATGT TAC AATGGT CGC-3扩增产物大小为292·bp。4.8无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 ·SN/T -1674—20145器材和设备5.1PCR扩增仪。5.2倒置显微镜。5.3电泳仪及电泳槽。5.4凝胶成像仪。5.5’生化培养箱。5.6高速冷冻离心机。5.7普通光学显微镜。6临床症状病鱼体表面发白、变红，表皮粗糙、点状或全部脱落，体表和鳃粘液分泌过量或很少分泌，鳃发白、溃烂，眼凹陷，体表和鳍条基部出血，鳍条溃烂。病鱼行动迟缓、离群，集聚在入水口、池塘边，身体失去平衡、游动没有方向感、活动过度。水温25℃～28℃是发病高峰，在各种鱼混养的地方，在水温20℃以上时，仅有鲤鱼和锦鲤死亡，且无论大小，从发病到死亡通常不超过48h。7采样按照GB/T18088规定的数量取样。优先选择1日龄以下、出现临床症状的活的或濒死的鱼。如待检鱼出现临床症状，取2尾鱼作为个样品进行检测；如待检鱼表面健康，取5尾鱼作为一个样品进行检测。体长超过6cm的鱼，取鳃、肾和脾组织；体长在3cm～6cm之间的鱼，取所有的内脏及鳃；体长小于3cm的鱼，去头和尾后取余下的鱼体。用于PCR检测的样品可以是新鲜的、冰冻的、80%～100%乙醇保存的；用于病毒分离的样品用冷藏容器或置于冰上送到实验室，避免冷冻。8组织病理学检查鳃部发炎、坏死，鳃丝上皮增生、肥大，二级鳃瓣融合，鳃丝粘连。鳃丝上皮细胞和白细胞的细胞核变大、染色质边缘化，有弥散性的嗜伊红的核内包涵体。肾脏、脾脏、胰脏、肝脏、脑和口腔上皮发炎、坏死、有核内包涵体。9病毒分离9.1实验室环境KHV病原分离鉴定的实验室环境条件应符合GB19489的要求。9.2样品处理先用组织研磨器将样品匀浆，再按1：10的最终稀释度悬浮于细胞培养液