SNT 1166.3-2006水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1166.32006水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)for yesicular stomatitis virus2006-08-16 实施2006~01-26 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1166.3-2006前言SN/T1166分为三部分：水泡性口炎补体结合试验操作规程；水泡性口炎微量血清中和试验操作规程；水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程。本部分为SN/T1166的第3部分。本部分的附录 A为规范性附录,附录B为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：花群义、周晓黎、徐自忠、董俊、杨云庆、龙忠保。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1166.3—2006水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程范围1SN/T1166 的本部分规定了水泡性口炎病毒新泽西型(NJ)和印第安那型(IND)的RT-PCR定性和定型检测方法。本部分适用于水泡性口炎病毒的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1166的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3.1 水应符合GB/T6682中一级水的规格。3.2试剂纯度所有的化学试剂均为分析纯。3.3水泡性口炎病毒标准株新泽西型(NJ)和印第安那型(IND)标准病毒株，由指定单位提供。3.4 Taq 酶-20℃保存，避免反复冻融或溫度剧烈变化。3.5逆转录酶AMV一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化3.6 RNA 抑制剂(RNasin)一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。3.7 dNTP含 dCTP,dGTP,dATP,dTTP 各 10 mmol/L3.8 引物3.8.1 该试验选用水泡性口炎病毒 L蛋白基因较保守的序列为 PCR 扩增区。采用半套式 RT-PCR方法，半套式引物分别根据NI株和IND株扩增区的碱基差别设计。外侧引物 I(P1):5’ AAG GCT CTC TGT TTC CGG ATC TGG 3′外侧引物 I(P2):5′ TGA TTC AAT ATA ATT ATT TTG GGA C3*NJ 半套式引物(P3):5′ TGT TCT GGT GTG CAA ACC AGG TAT C 3*IND 半套式引物(P4):5’AGT AGA ACT GTG CAA GCC CGG TAT C 33.8.2用DEPC水将引物配制成浓度为25pmol/μL。3.9异戊醇使用前预冷到一20℃。 SN/T 1166.3--20063.10矿物油要求无 DNA酶和 RNA酶。3. 11变性液、抽提液 1、抽提液 2、5 倍逆转录酶缓冲液、TBE 电泳缓冲液、10 倍 Taq 酶缓冲液、EB 核酸染色液、上样缓冲液、DEPC处理水配制方法见附录A。4器材和设备PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、凝胶图像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱和低温冰箱、电动勾浆器或组织研磨器、离心机和离心管。5操作方法5.1被检样品的采集和处理5.1.1被检样品的采集样品主要采集动物口、蹄冠上或乳头上的水泡上皮组织，采集后立即冷藏送检或置缓冲甘油（用0.01mo1/LpH7.2的PBS配制的50%的甘油溶液)中低温保藏；采集到的水泡液置灭菌瓶中，冷藏送检或低温保藏；若从冻肉中采样，可采集淋巴结或组织；采集的精液样品应不少于1mL，冻精样品每头每批次取样3管～5管；无症状或无水泡的活动物采集抗凝全血；胚胎及其冲洗液；细胞培养物。5.1.2被检样品的处理将采集到的上皮、淋巴结或组织样品，经研磨后用0.01mol/L pH7.2的PBS配制成20%的悬液。精液用乳糖蛋白陈缓冲肉汤(BLP，配制见附录A第A.10章）作1：5稀释后，经11000r/min低温离心30 min,弃上清液，并弃去浮游脂肪,再用BLP作1：5稀释成悬液；全血、胚胎及其冲洗液、细胞培养物无需处理。取450μL样品悬液放人1.5mL的离心管，再加人450μL变性液并混匀，旋涡振荡混合20 s,冰浴 15 min.5.2对照样品制备和处理5.2.1阳性对照样品制备将水泡性口炎病毒 NJ 型和 IND型分别接种 BHK-21