NY_T 3421-2019家蚕核型多角体病毒检测 荧光定量PCR法.pdf

ICS 07.080B 47NY中华人民共和国农业行业标准NY/T蚕核型多角体病毒检测荧光定量PCR法Detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirusReal time PCR method2019-01-17 发布2019-09-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3421—2019前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由农业农村部种植业管理司提出。本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会(SAC/TC437)归口。本标准起草单位：江苏科技大学、西南大学、中国农业科学院蚕业研究所、苏州大学、华南农业大学、农业农村部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心（镇江）。本标准主要起草人：吴萍、潘敏慧、郭锡杰、贡成良、孙京臣、董战旗、陈涛、侯启瑞、商琪。一 NY/T 3421—2019家蚕核型多角体病毒检测荧光定量PCR法1范围本标准规定了家蚕核型多角体病毒（Bombyamorinucleopolyhedrovirus，BmNPV）的实时荧光定量PCR检测方法。本标准适用于家蚕核型多角体病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1gp64基因gp64 gene杆状病毒囊膜蛋白基因,编码出芽型病毒粒子囊膜融合蛋白GP64。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BmNPV:家蚕核型多角体病毒(Bombya mori nucleopolyhedrovirus)Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethreshold)dNTPs：脱氧核苷三磷酸混合液（deoxyribonucleosidetriphosphatesmixture），由4种脱氧核糖核苷酸dATP、dTTP、dGTP和dCTP等量混合而成的溶液PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline）PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)SDS：十二烷基磺酸钠（sodiumdodecyl sulfate）5原理利用荧光信号伴随目的PCR产物的增加而增强的原理，收集PCR扩增过程的荧光信号值，根据Ct值判断供试样品是否含有家蚕核型多角体病毒。根据BmNPVgp64基因的保守序列设计特异性PCR引物进行PCR扩增反应。6试剂与材料6.120%SDS:称取20gSDS溶解于200mL烧杯中，加人80mL水，60℃水浴加热并用玻璃棒充分搅拌至溶解，定容至100mL。高压灭菌后，置于4℃冰箱保存备用。6.26mol/LNaCl:称取351gNaCl放人容量为1L的烧杯中，加人800mL水，玻璃棒充分搅拌至溶解，定容至1L。高压灭菌后，置于4℃冰箱保存备用。6.3蛋白酶K20mg/mL：称取200mg蛋白酶K加人到9.5mL水中，轻轻摇动，至蛋白酶K完全溶解，加水定容至10mL，分装成小份置于一20℃冰箱保存备用。1 NY/T 3421—20196.470%乙醇。6.5异丙醇。6. 6 PBS(组分: NaCl 136. 89 mmol/ L; KCl 2. 67 mmol/ L; Na2 HPO4 8. 1 mmol/ L; KHz PO4 1. 76mmol/L;pH=7.2~7.4)。6.7 苯基硫脲。6.8 RNasc 酶。6.9荧光定量PCR试剂盒。6.10灭菌的枪头和离心管。注：除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682一级水的规定。7主要仪器设备7.1实时荧光定量PCR仪。7.2紫外分光光度计。7.3高速冷冻离心机。7.4-20℃冰箱和一80℃冰箱。7.5组织研磨器或研钵。7.6微量加样器。8样品8.1样品采集8.1.1血液：用灭菌针刺破家蚕幼虫腹足或尾足，在冰上将血液采集于加了少量苯基硫脲的试管中，12000g，4℃离心30min，吸取上清液，一20℃冰箱保存备用。8.1.2组织：采集家蚕组织（50mg～100mg）后迅速放人液氮中，再转移至一80℃冰箱保存备用。8.2样品DNA提取8.2.1将组织样品放人预冷的研钵中加人液氮，用研杵将待检样品磨成粉末状，研磨过程中保持液氮不挥发干净。亦可用组织匀浆器按操作说明书处理样品。8.2.2在血液或按步骤8.2.1制备的样品中加人400μL灭菌的PBS、4μL10mg/mLRNase酶、40μL20%SDS和8μL20mg/mL蛋白酶K，混合均匀，并将样品置于55℃～60℃水浴10min～15min，或者放置室温直至溶液澄清