SN_T 3288-2012柠檬干枯病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3288—2012柠檬干枯病菌检疫鉴定方法Quarantine and identification of Phoma tracheiphila (Petri) L. A. Kantsch.etGikaschvili2013-05-01实施2012-10-23发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准柠檬干枯病菌检疫鉴定方法SN/T3288—2012*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880X×123001/16印张0.75字数17千字2013年4月第一版2013年4月第一次印刷印数1—1600*书号：155066·2-24686 SN/T 3288-2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准参照欧洲地中海植物保护组织EPPOPM7/48（2)“柠檬干枯病菌诊断规程”标准，其图片均来自采用的规程。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：钟国强、冯黎霞、朱金国、华丽、赵立荣、吴海荣、王其苑、刘海军。I SN/T 3288—2012柠檬干枯病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了柠檬干枯病菌Phomatracheiphila（Petri)L.A.Kantsch.etGikaschvili的检疫鉴定方法。本标准适用于来自柠檬干枯病菌发生国家或地区柑橘属寄主（citrus spp.）中柠檬干枯病菌的检疫鉴定。2柠檬干枯病菌基本信息学名:Phoma tracheiphila (Petri) L. A.Kantsch. et Gikaschvili异名:Deuterophoma tracheiphila PetriBakerophoma tracheiphila (Petri) Cif.英文名：Mav seccodisease of citrus分类地位：半知菌亚门Deuteromycotina，腔孢纲Coelomycetes，球壳孢目Sphaeropsidales，球壳孢科 Sphaeropsidaceae，茎点属 Phoma寄主与分布：参见附录A。传播途径：病原菌主要通过带有菌丝的果实、带有菌丝及子实体的植株茎干、枝条作远距离传播，其中产生于植株外表的子实体可用肉眼观察。3方法原理病原菌在寄主植株上的症状特点、病原菌形态学特征、培养性状（参见附录B)以及病原菌PCR特异性检测结果（见附录C)为柠檬干枯病菌的检疫鉴定依据4设备和试验用具4.1仪器设备体式显微镜、生物显微镜、超净工作台、恒温培养箱、移液器、凝胶成像系统、电泳设备、PCR仪、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅。4.2试验用具刀具、手持放大镜、灭菌培养皿、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、载玻片、盖玻片等。5试剂和培养基5.1试剂氯化钠（NaCI)、硝酸钠（NaNO）、磷酸二氢钾（KH,PO,）、氯化钾（KCI）、硫酸镁（MgSO.·7H²O)、1 SN/T 3288—2012硫酸铁（FeSO）、Tris-HCI缓冲液、EDTA、十二烷硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无水酒精、异丙醇、TE缓冲液、TAE缓冲液。5.2培养基PDA培养基：马铃薯200g切碎，加蒸馏水煮熟，用纱布过滤马铃薯，取滤汁加葡萄糖20g、琼脂17g～20g，加水补足1000mL煮至琼脂完全溶化后，过滤灭菌备用。CaA培养基：胡萝卜200g切片，置搅拌机内，加蒸馏水500mL高速搅拌40s，用4层纱布过滤，取滤汁加琼脂15g，加蒸馏水补足至1000mL，高压灭菌备用。CDA培养基：硝酸钠（NaNO3）3g，磷酸二氢钾（KHzPO）1g，氮化钾（KCI）0.5g，硫酸镁（MgSO，·7H20)0.5g，硫酸铁（FeSO)0.01g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，将以上成分煮至完全溶化，高压灭菌备用。6检验方法6.1现场检验检查来自于柠檬干枯病菌疫区的寄主植物，尤其是柠檬植物，观察嫩芽或枝条有无褪绿，回枯现象用刀具剥开表皮，观察木质部是否有典型的鲑鱼肉色或橙红色症状，选取褪绿、回枯或病斑上有黑点（分生孢子器）的枝条，带回实验室作进一步检验。抽取柠檬干枯病菌疫区的水果果实回实验室检验。6.2实验室检验6.2.1活枝条分离检验切开枝条表皮，将带有鲑鱼肉色或橙红色症状的嫩枝切成2mm～5mm厚度的小块组织，根据切块的厚度、大小，表面用0