SNT 2101-2008乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法 荧光定量PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2101-2008乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法Determination of Mycobacterium tuberculosis for milk and milk products--Real-time PCR method2009-02-01实施2008-07-17 发布中华人民共和国发布是获 影1诱查询测国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2101---2008前言本标准附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴斌、胡传伟、贾、李叶、李振荣、孙颖杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 2101-2008乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量 PCR 法1范围本标准规定了乳及乳制品中牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于鲜乳、乳粉中结核分枝杆菌的检测，其他乳制品可参照执行。2原理乳及乳制品中结核分枝杆菌荧光PCR检测方法是采用经典的iTaqMan探针技术。根据牛型和人型结核分枝杆菌的保守序列设计对特异性引物及一条特异性荧光双标记探针，探针的5端和3端分别用FAM和TAMRA荧光素标记。当PCR反应退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上报告荧光基团FAM发出的荧光信号被淬灭荧光基团TAMRA所吸收，仪器检测不到FAM基团所发出的荧光信号；当 PCR反应进行延伸时，Tag.酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链，当进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq 酶发挥它的5→3外切核酸酶的功能,将探针切成单核苷酸以便继续完成延伸过程，而 FAM基团和 TAMRA基团均游离于溶液中，仪器可检测到FAM基团所发出的荧光信号。3缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 1PCR荧光荧光聚合酶链反应。3. 2Ct 值每个反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数3.3DNA脱氧核糖核酸。3.4Taq 酶Taq DNA 聚合酶。4材料与试剂4.1仪器与器材4.1.1荧光PCR检测仪。4.1.2高速台式冷冻离心机。4.1.3普通台式离心机。4.1.4涡旋振荡器。4.1.5冰箱:4℃±1℃，,20℃±2℃。 SN/T 2101-20084.1.6微量可调移液器及配套带滤芯吸头。 mL Eppendorf 管。4. 1.810 mL离心管。4.1.9一次性手套。4.1.10紫外灯。4. 1. 11生物安全柜。4.2 试剂除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。4.2.14%氢氧化钠：见第A.1章。%灭菌生理盐水：见第 A.2章。4.2.320 mg/mL蛋白酶K:见第 A.3章。4.2.4 10% SDS:见第 A. 4 章。4.2.5pH 5.2 3 mol/L醋酸钠:见第 A.5 章。4.2.6 pH 8.0 TE缓冲液:见第 A.6 章。4.2.7结核分枝杆菌卡介苗阳性样本：由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。4.3　抽样、采样工具采样工具(棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、研钵)应经121℃士2℃,15min高压灭菌并烘干。4.4检测引物和探针见表1。表 1 荧光定量 PCR 检测引物和探针引物和探针序列扩增片段大小/bp正义引物 P1:5’-GGTCGACACATAGGTGAGGTCT-3反义引物 P2:5-CGCTGATCCGGCCAC-3103探针:5′-FAM-CCGAAGCGGCGCTGGACGAG-TEMRA-35操作方法5.1样品采集5.1.1鲜乳的采集用无菌注射器直接吸取5 mL至10 mL离心管中,编号备用。5.1.2乳粉的采集无菌操作取25g样品，放人无菌袋中，编号备用。5.2样品贮运样品采集后，4℃保存应不超过24h，若需长期保存应置一20℃以下，但应避免反复冻融，或放于加人冰块的保温箱中，密封后直接送实验室检测。5.3样品制备5.3.1鲜乳样品在混匀器上充分混合后，经4000r/min离心40min，弃上清液，加人5mL生理盐水重悬沉淀，定性滤纸过滤，滤液经4000 r/min离心40 min，弃上清液，加人500 μuL生理盐水重悬沉淀，编号备用。5.3.2乳粉无菌操作取待检样品5.0g放人灭菌烧杯中，加50mL生理盐水，剧烈振荡混匀，4000r/min离心40 min，弃上清液，加人10 mL生理盐水重悬沉淀，定性滤纸过滤，滤液4000 r/min离心40 min，弃上清液，加人500uL生理盐水重悬沉淀，编号备用。2 SN/T 2101—20085.4DNA 提取5.4.1在样品中加人1.5mL4