细菌的生理生化鉴定方法.docxVIP

方法 2.3.5细菌的生理生化鉴定 1、形态学观察 采用插片法、埋片法，对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏 染色进行油镜观察。 革兰氏染色 溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番 红复染液等。 试验步骤：(1)涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片(不易过厚)、干 燥和固定。 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1?2 min，用水冲洗至流出 水无色。 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1 min，倾去碘液， 水洗至流出水无色。 脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液(一般20?30s)，当脱色至流出 液无色时立即用水洗去乙醇。 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗， 用吸水纸吸去残水晾十。 镜检：用油镜观察。 芽孢染色 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹 住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5 min，加热时应注意补充染液，切 勿让涂片干涸。 脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。 复染：用0.5%番红水溶液复染2min。 水洗：用缓流自来水冲洗至无色。 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。 鞭毛染色(硝酸银染色法) 载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后 用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可 能残留的油迹。 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1?2mL无菌水中制成菌 悬液，不能剧烈震荡。 制片：取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边， 用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。 染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3?5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴 加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水 冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 镜检：用油镜镜检观察。 A、B液需现用现配(4h内效果最佳，1d内可用)： A：单宁酸5 g，三氯化铁1.5 g，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15% 甲醛2mL。 B：硝酸银粉末2 g，水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用，往90mL 溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴 至出现薄雾。 2、糖类分解试验 配方：蛋白胨1.0g； NaCl 0.5 g； 0.2%漠百里香酚兰1.2mL；葡萄糖1.0 g;蒸馏水100mL。 基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利 用分解某种糖产生有机酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氨气、甲烷、二 氧化碳等)。当发酵产酸是，指示剂可有紫色(pH6.8)转变为黄色(pH5.2)。气 体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。 试验步骤：用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的 编号。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行， 可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡。 再将将上述已接种的和对照管置37°C温室中培养2?3d。观察颜色变化及小试管 中有无气泡。 3、V-P试验 配方：蛋白胨 1.5g；葡萄糖 1.5g； K2HPO41.5g；蒸馏水 300mL； pH： 7.4 基本原理：此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。某些细菌能分解葡 萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境再被空 气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称 V-P反应。 试验步骤：将被检菌接种于试验培养基中，培养2?7d后，于培养物中加入 1mL 10%的NaOH，混匀，再加入3?4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基 表面的下层出现红色者，为阳性。 4、甲基红试验 配方：与V-P试验的配方相同 基本原理：某些细菌在糖代谢过程中，会分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸还 可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH将至4.5以下，当加入 甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量小，或者产 生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度 仍会在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。 试验步骤：接种细菌于培养基，在37°C培养2?7d后，于培养物中加入几 滴甲基红酒精溶液（0.1 g甲基经溶于300mL 95%乙醇中，加蒸馏水至500 mL）， 如呈红色，表示阳性。 5、柠檬酸盐利用试验 配方：柠檬酸钠 1 g；硫酸镁 0.2 g； NaCl 5 g； NH4H2PO4 1 g； K2HPO4 1g；琼脂20 g； 1%漠麝香草酚蓝酒精溶液10mL；蒸馏水1000mL。