SN 1632.2-2005奶粉中阪岐肠杆菌检验方法 第2部分：PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1632. 2--2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分:PCR方法Detection of Enterobacter sakazakii from dehydrated powdered milk--Part 2 : PCR method2005-08-18 发布2006-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1632.2---2005前言SN/T1632《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法》分为三个部分：第1部分：分离与计数方法；第2部分：PCR方法；第3部分：荧光PCR方法。本部分为SN/T1632的第2部分。本部分的附录 A为规范性附录,附录B为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：高旗利、张霞、罗茂凰、张海滨、张海英、赵贵明、姚霞。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1 SN/T 1632.2—2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分:PCR方法1范围SN/T 1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌的PCR检验方法。本部分适用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检验，其他食品可参照执行。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1632本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。SN/T1632.1奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分：分离与计数方法3定义、术语和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于SN/T1632的本部分。3. 1阪崎肠杆蘭 Enterobacter sakazakii阪崎肠杆菌为肠杆菌科肠杆菌属革兰氏阴性无芽孢杆菌，周身鞭毛有动力，大多数产黄色素，具有α-葡萄糖苷酶活性。3.2聚合酶链式反应 polymerase chain reaction聚合酶链式反应,简称 PCR。使用两段(通常长度为 15 个～25个核苷酸)寡脱氧核苷酸作为反应的引物，这两段寡脱氧核苷酸引物的序列应不发生互补作用，但它们可以和称为模板的待测DNA两条链上的特定位点分别发生互补。反应液包括含有镁离子的反应缓冲液、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、模板 DNA、引物及热稳定DNA聚合酶组成。在DNA聚合酶催化下，通过温度数十个循环的反复变化（DNA变性、退火及延伸)而获得两个互补位点之间DNA片段的大量拷贝。3.3缩路语3. 3. 1 PCR:polymerase chain reaction,简称 PCR。3.3.2 DNA;deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。3.3.3 dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。3.3.4 dATP:deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷二磷酸。3.3.5dCTP:deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸。3.3.6dGTP:deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸。3.3.7 dTTP:deoxythymidine triphosphate,脱氧胸苷三磷酸。3.3.8 dUTP:deoxyuridine triphosphate,脱氧尿苷三磷酸。3. 3. 9UDG:uracil DNA glycosylase,尿嘧啶 DNA-糖基酶。3. 3. 100bp:base pair,碱基对。3.3.11 Taq:Thermus aquaticu,水生栖热菌。1 SN/T 1632.2—20053.3. 12 Tris:tris(hydroxymethyl) aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷。3. 3. 13 TE: Tris-HC1、EDTA 缓冲液。4检验方法4.1方法提要奶粉经增菌后,采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取 DNA,以提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增,琼脂糖凝胶电泳检验 PCR产物是否有特征条带，从而对奶粉中是否污染阪崎肠杆菌进行快速检验。4.2试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。4.2.1改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤(MLST)(见附录 A.1)。4.2.2脑心浸液(BHI)（见附录第A,2章）。4.2.3营养肉汤(NB)(见附录第 A.3章）。4.2.4 引物:5′-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-35′-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-34.2.5 Taq DNA 聚合酶。4.2.6