SN_T 2973-2011鲍鱼立克次氏体病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2973—2011鲍鱼立克次氏体病检疫技术规范Quarantine protocol for xenohaliotis californiensis2011-09-09 发布2012-04-01实施中华人民共和国发布(0国家质量监督检验检疫总局数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准鲍鱼立克次氏体病检疫技术规范SN/T 2973--2011*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址: www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印厂印刷*开本 880×12301/16 印张 1字数 25 千字2012年3月第一版反2012年3月第一次印刷印数 1—1 600*书号：155066·2-23042 SN/T 2973--2011前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准与国际动物卫生组织（OIE)《水生动物疾病诊断手册》（2009年版）中第2.4.7章Infectionwith Xenohaliotis Californiensis”一致性程度为非等效。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：岳志芹、赵玉然、吴斌、刘、李叶、辛学谦、史秀杰、苏永生、梁成珠。I SN/T 2973—2011鲍鱼立克次氏体病检疫技术规范1范围本标准规定了鲍鱼立克次氏体病的组织病理学观察、PCR方法和原位杂交检疫技术规范本标准适用于鲍鱼立克次氏体病的常规检测,适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样3设备与试剂3.1设备3. 1. 1普通光学显微镜。3.1.2一80℃低温冰箱。3.1.3组织研磨器。3. 1. 4切片机。3.1.5PCR仪。3.1.6电泳仪。3.1.7凝胶成像仪或紫外观察灯。3. 2试剂3.2.1染色剂：常规涂片及组织学染色剂（有关染液见附录A）。3.2.2蛋白酶K(见附录 A)。3.2.3石蜡。3.2. 4二甲苯。3.2.5无水乙醇。3.2.675%的乙醇。3.2.7硫酸镁（MgSO4）。3.2.8dNTP。3.2.9Taq DNA 聚合酶及 PCR缓冲液（附录 A）。3.2.10 DNA 2000 Marker.3.2.11核酸染料(EB)。3.2.12琼脂糖。3.2.13Davidsons 固定液(附录 A)。3.2.14PCR产物纯化试剂盒。3.2.15地高辛标记试剂盒。 SN/T 2973—20114样品的采集4.1样品的选择根据GB/T18088规定的数量采样,匀浆后取样品25mg～100mg置于1.5mL离心管中。为了优化检测，采取针对性抽样，需要选择表现为体重下降、足部肌肉萎缩临床症状的鲍鱼。4.2样品的保存样品保存在乙醇（体积比1：9)中，可存放于4℃～20℃；或用液氮速冻；或存放于-80℃超低温冰箱中。样品运输时需用干冰保存4.3采样器官和组织最佳的采样组织是后食道，箕次是消化腺。5检测方法5. 1组织学诊断方法5.1.1切取若干 3mm～5 mm 的后食道、消化腺和足部肌肉的截面,将其放在 Davidsons固定液中24h然后制作常规石蜡组织切片，固定液的体积应至少为组织体积的10倍。5.1.2切片用苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察后食道和消化腺中的细菌内含体（长椭圆形，14μm～56 μm的适碱性胞浆内空泡），以及消化腺和是部的形态变化。建议放大200倍或 400 倍进：步观察切片。5.2聚合酶链式反应(PCR)5.2.1采样部位后食道或者是消化腺，推荐后食道的组织，因为通常后食道的感染比消化腺的感染更严重。5.2.2核酸的抽提用经典的酚三氯甲烷萃取法(见附录B)或者商业化DNA取试剂盒。5.2.3引物的设计引物序列如下：RA 5-1 :5-GTT-GAA-CGT-GCC-TTC-AGT-TTA-C-3;RA 3-6:5-ACT-TGG-ACT-CAT-TCA-AAA-GCG-GA-3该PCR引物可以特异的扩增鲍鱼立克次氏体病原体的-个158pb大小的片段。5.2.4 PCR 扩增体系PCR扩增在标准的 20 μL的反应体系中进行,包括1× PCR缓冲液,1.5 mmol/I.MgCl²，400 ng/mlBSA,200 μmol/L 的 dNTPs,10 pmol/L 引物各 0. 5 μL,1.6 U