SN 1195-2003大豆中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1195—2003大豆中转基因成分的定性PCR检测方法1Protocol of the qualitative polymerase chain reaction (PCR)for detecting genetically modified component in soybeans.2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1195—20031前言：本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。1本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：蒋原、祝长青、林宏。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。?1111 SN/T 1195—2003大豆中转基因成分的定性 PCR检测方法1 范围本标准规定了大豆中转基因成分的定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法。本标准适用手大豆中抗草甘麟转基因大豆(roundup ready soybean)中的转基因成分的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法1SN/T 1193基因检验实验室技术要求-SN/T 1194植物及其产品转基因成分检测的抽样和制样方法SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3. 1转基因成分 genetically modified component将物种本身不具有的、而是来源于其他物种的功能基因序列。3. 2聚合酶链式反应 ploymerase chain reaction (PCR)模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在 DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。3.3缩略语3.3.1Lectin:植物凝集素基因,为大豆本身含有的内源基因。3.3.2 CaMV 35S:35S promoter from cauliflower mosaic virus,花椰菜花叶病毒 35S 启动子。3. 3. 3 NOS: Terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens,来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。3. 3. 4 CP4 EPSPS:5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene,5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因。/3.3.5RRS:roundup ready soybean，美国 Monsanto 公司的获准商品化种植的抗除草剂草甘麟的转基因大豆,转人外源基因有CaMV35S启动子,NOS终止子和 CP4-EPSPS基因等。↓ SN/T 1195—20034防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照 SN/T 1193中的规定执行。5抽样和制样5.1抽样按照SN/T1194中规定的方法执行。5.2制样称取约50g大豆样品，用湿热灭菌（121℃处理30min)或干热灭菌（180℃处理2h)的研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至约0.5mm左右。测定方法66.1原理根据RRS转基因大豆生物基因组中含有的外源基因序列设计出特异性引物，利用PCR方法对这段外源基因的序列片段进行扩增，根据实验结果来判定被检样品的核酸中是否含有RRS的转基因成分。6.2试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂。6. 2. 1 CTAB 缓冲液:CTAB 20g/L, Tris-HC1 0. 1 mol/L(pH8. 0),EDTA 0. 02 mol/L.6. 2. 2Tris 饱和酚。6.2.33三氯甲烷：异戊醇(24：1)。6.2.4异丙醇。6.2.570%乙醇。6.2.6TE 溶液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH8.0)。6.2.7RNA 酶溶液:5 μg/μL。6.2.810XPCR反应液。6.2.9氯化镁(MgClz):25 mmol/L。6.2. 10dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP)溶液:各 2. 5 mmol/L。6. 2. 11Taq 酶:5 U/μL