SN_T 4624.6-2016入境环保用微生物菌剂检测方法 第6部分：金黄色葡萄球菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.6-2016入境环保用微生物菌剂检测方法第6部分：金黄色葡萄球菌Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 6 : Staphylococcus aureus2017-03-01实施2016-08-23 发布中华人民共和国发布KO国家质量监督检验检疫总局刮涂层梦岸 SN/T 4624.6—2016前言SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；第2部分：短小芽孢杆菌；第3部分：巨大芽孢杆菌;第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分:β型溶血性链球菌;一第6部分：金黄色葡萄球菌；-第7部分：沙门氏菌；第8部分：志贺氏菌；第9部分：致泻大肠埃希氏菌；第10部分：淡紫拟青霉；第11部分：雅致小克银汉霉；第12部分：哈茨木霉；第13部分：黄孢原毛平革菌；一第14部分：焦曲霉；第15部分：解淀粉芽孢杆菌；第16部分：类产碱假单胞菌；第17部分：恶臭假单胞菌。本部分为SN/T4624的第6部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本部分主要起草人：李成镛、王、蒋施、刘瑜、侯彤言、付洋、王芳。I SN/T 4624.6—2016入境环保用微生物菌剂检测方法第6部分：金黄色葡萄球菌1范围SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光 PCR检测方法。本部分适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基3.1实验用水应符合GB/T 6682中-级水的规格。3.22生理盐水:见附录 A中 A.1。3.37.5%氯化钠肉汤：见A.2。3.4血琼脂平板：见 A.3。3.5 Baird-Parker 琼脂平板:见 A.4。3.6脑心浸出液肉汤(BHI)：见A.5。3.7兔血浆:见 A.6。3.8革兰氏染色液：见A.7。3.9营养琼脂小斜面：见 A.8。3.10DNA 分子量标记:100 bp DNA ladder。3.11dNTP:dATP、dTTP、dGTP、dCTP。3.12TBE:见 A.9。3.13Taq DNA 聚合酶。3.14细菌基因组 DNA 提取试剂盒。3.15琼脂糖。3.16溴化乙锭。4主要仪器和设备4.1电子天平(感量0.01 g）。4.2恒温培养箱：36℃±1℃。4.3恒温水浴锅。4.4台式冷冻离心机（最高转速 15 000 r/min)。 SN/T 4624.6--20164.5PCR扩增仪。4.6实时荧光PCR仪。4.7微量移液器和灭菌吸头:10μL、20 μL、200 μL、1000 μL。4.8高压灭菌锅。4.9PCR超净工作台。4.10电泳仪。4.11核酸/蛋白分析仪。4.12凝胶成像系统。4.13无菌培养皿:直径 90 mm。5样品制备以无菌操作取1g(mL)样品加人到100ml生理盐水中混匀，从中移取25 mL加人到225 mL灭菌生理盐水中混匀。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。6形态学及生化鉴定6.1增菌从上述样品匀液中取25mL加人到225mL的7.5%氯化钠肉汤的均质袋中混匀，于36℃土1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板 36℃±1℃培养18 h～24 h。Baird-Parker 平板 36℃±1℃培养18 h～24 h 观察记录菌落特征，必要时可将培养时间延长至 45 h～48 h。6.2　分离金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为 2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。6.3染色、镜检染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排