SN 1379.1-2004猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1379. 1—2004猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验Protocol of the enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodyfor the detection of antibodies against classical swine fever virus2004-06-01 发布2004-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局码防伪 SN/T 1379. 1—2004前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国广东出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：许如苏、郭奕亮、肖德雄。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标推。 SN/T 1379. 1—2004猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验1 范围本标准规定了单克隆抗体酶联免疫吸附试验(间接法)检测猪瘟抗体的方法。本标准适用于猪瘟的检疫、诊断和疫苗免疫监测。2仪器设备2.1 酶标板。2.2可调移液器。2.3恒温培养箱。2.4　电子天平：感量0.001g。2.5 酶标检测仪。3 试剂3.1 诊断试剂3.1.1猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原。3.1.2猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原。3.1.3 标准阴性血清。3.1.4标准阳性血清。3.1.5酶标二抗（兔抗猪1gG-辣根过氧化物酶结合物）。3.2 被检血清:无溶血、无污染。3.3溶液3.3.1试验所需溶液包括：包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）；F磷酸缓冲盐水（PBS);磷酸缓冲盐水-吐温(PBS-T)洗涤液;一稀释液(PBS-T-BS);一邻苯二胺(OPD)底物液:使用前配制;终止液(2 mol/L H,SO)。3.3.2溶液配制见附录A。注；诊断试剂由中国兽药监察所生产。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果有其他等效产品，则可按其使用说明书使用。4操作方法4.1包被用包被液将猪瘟病毒（强毒或弱毒）单抗纯化酶联抗原作100倍稀释，每孔加人100uL，置湿盒于4℃过夜。4.2洗板弃去孔内液体，用洗涤液洗板三次，每次3min～5min，甩干孔内残液，于滤纸上拍打吸干。 SN/T 1379.1—20044.3加被检血清和标准血清用稀释液将待检血清作 400倍稀释,每孔加100μL。同时将标准阴性、阳性血清分别作 100 倍稀释作对照,37℃培育1.5 h～2 h。4.4洗板重复4.2。4.5加酶标二抗用稀释液将兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶结合物稀释至工作浓度，每孔加人100 uL，37℃培育1. 5 h~2 h.4.6洗板重复4.2。4.7加OPD底物溶液每孔加人底物溶液 100 μL,，室温下避光反应5min～15 min。4.8终止反应当标准阳性血清对照孔呈黄色，标准阴性血清对照孔无色或略微显色时，每孔加人50红L终止液终止反应,5 min 内测定光密度。4.9测定光密度以标准阴性血清对照孔作空白调零，于酶标仪上测定 490 nm 波长的光密度(OD)。5判定标准5.1在猪瘟弱毒酶联板上,标准阳性血清对照孔 OD大于等于 0.2 时,试验成立,按以下标推判定结果：a)(OD大于等于0.2,为猪瘟弱毒抗体阳性；b）OD小于0.2,为猪瘟弱毒抗体阴性。5.2在猪瘟强毒酶联板上,标准阳性血清对照孔 OD 大于等于 0.5 时,试验成立,按以下标准判定结果：a)OD大于等于0.5,为猪瘟强毒抗体阳性；b）OD小于0.5,为猪瘟强毒抗体阴性。2 SN/T 1379. 1—2004附录A(规范性附录)溶液配制A.1包被液(pH 9.6碳酸盐缓冲液)碳酸钠（NazCOs）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO:)2.93g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至 1 000 mL。A.2 磷酸缓冲盐水(PBS)磷酸氢二钠(NazHPO)2.13g，磷酸二氢钾(KH²PO)0.2 g，氯化钠(NaCI)8.0g，氯化钾（KCI)0.2g,先加适量的双蒸水,完全溶解后加双蒸水定容至 1000mL。pH 应为7.4,否则,须用3mol/L氢氧化钠调pH为7.4。A.3磷酸缓冲盐水-吐温(PBS-T)洗涤液PBS 1 000 mL,吐温-20(Tween-20)0.5 mL,混匀。A. 4稀释液(PBS-T-BS)PBS-T 100 mL,小牛血清 5 mL,混匀。A.5邻苯二胺(OPD)底物液A.5.1称取柠檬酸(C。H.O，·H²O)21g,先加适量的双蒸水,完全溶解后加双蒸水定容至1 000mL，配成0.1 mol/L柠檬酸液。A.5.2称取磷酸氢二钠(NazHPO4·12H,O)71.6 g，先加适量的双蒸水,完全溶解后加双蒸