SN_T 4877.6-2017基因条形码筛查方法 第6部分：检疫性嗜酸菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4877.6--2017基因条形码筛查方法第6部分：检疫性嗜酸菌DNA barcoding screening method-Part 6 :Quarantine Acidovorax spp.2017-08-29 发布2018-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SW、刮涂层查真伪 SN/T 4877.6—2017前言SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；-第2部分：检疫性黄单胞菌；I第3部分：检疫性植原体；第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；第6部分：检疫性嗜酸菌;第7部分：检疫性轮枝菌;第8部分：检疫性炭疽菌;第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉。本部分为SN/T4877的第6部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：冯建军、赵文军、田茜、汪莹、龙海、程颖慧、郑耘、章桂明、陈枝楠。I SN/T 4877.6-—2017基因条形码筛查方法第6部分：检疫性嗜酸菌1范围SN/T 4877 的本部分规定了 Acidovorar citrulli、Acidovora cattleyae 和 Acidovorax konjaci 三种检疫性嗜酸菌的DNA 条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于 Acidovorax citrulli、Acidovorar cattleyae 和 Acidovorar konjaci 三种检疫性嗜酸菌的筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1465西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法SN/T 3681魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA 条形码DNA barcode生物体内能够代表该物种的,标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2内部转录间隔区 internal transcribed spacer;ITS在 rDNA基因中,位于保守 16S 和 23S rDNA 间隔区之间的序列,包括部分 tRNA基因和一些非编码区，由于进化选择压力较小，ITS序列比16S和23S rDNA序列本身的变异性更大，因此，ITS适合用于细菌种下不同群体的特异性检测与鉴定。4嗜酸菌的基本信息学名：Acidovorar分类地位：细菌界（bacteria），薄壁菌门（Gracilicutes）假单胞菌科（Pseudomonaceae）嗜酸菌属（Acidovoraα），属 rRNA组I。目前植物性嗜酸菌有 5个种,其中前 3个为进境植物检疫性有害生物。瓜类细菌性果斑病菌 Acidovorax citrulli(Schaad et al.1978)Schaad et al.2008兰花褐斑病菌 Acidovorax cattleyae(Pavarino 1911)Schaad et al.2008魔芋细菌性叶斑病菌Acidovorar konjaci(Willems et al.1992)燕麦嗜酸菌 Acidovorar avenae(Manns 1909)Willems et al.1992,Schaad et al.2008水稻褐条病菌 Acidovorar oryzae(Schaad et al.2008)1 SN/T 4877.6—20175　方法原理根据嗜酸菌属16S-23SrDNA的.ITS序列分析对检疫性嗜酸菌进行DNA条形码筛查。6仪器、用具及试剂6.1仪器PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、微量分光光度仪、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统。6.2　用具可调移液器（最大量程为20μL、200μL、1000uL）及相关吸头、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。6.3培养基和试剂营养肉陈液体培养基（NB)配方为3g牛肉浸膏（Beef extract）,5 g蛋白陈(Peptone），1 000 mL蒸馏水，pH值为7.0～7.2,121℃灭菌15min。若是需要固体平板培养基，加人15g琼脂粉（Agar)灭菌后倒人培养Ⅲ中即可配制成NA培养基。所有试剂见附录 A、附录 B。7筛查方法7.1 DNA 制备对拟筛查的分离物进行液体培养或平板培养，利用CTAB法或商品化细菌DNA提取试剂盒提取制备DNA，测定DNA浓度及纯度测定后