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一文读懂p16Ki-67双染在宫颈癌中的应用 1宫颈癌简介 宫颈癌是世界范围内女性第四大常见恶性肿瘤， HPV感染是发病的重要原因。某些HPV亚型，特别是高危型16和18的持续宫颈感染会导致不可逆的改变，进而进展为原位癌，最终发展为侵袭性宫颈癌，主要是受到HPV基因组中E6和E7的影响。HPV DNA整合到宿主基因组中可诱导E6和E7的表达。E7与视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)结合并致其失活，活化细胞周期。E6结合p53蛋白并使其失活，并通过E7失活pRB协同解除细胞周期的调控。E6和E7的表达使原始角质细胞无限增殖分裂是诱导和维持宫颈癌细胞表型转化所必需的前提条件。 通过各种筛查技术的早期诊断是预防和治疗宫颈癌的主要措施。目前，宫颈癌筛查主要采用细胞学、HPV检测和细胞学结合HPV检测三种方法。基于细胞学的巴氏涂片是最早应用的宫颈癌筛查方法。细胞学诊断为ASCUS/ LSIL的患者通常需要随访，因为其中一些可能发展为CIN2+。因此有必要根据初步筛选结果建立有效的生物标志物来对不同的患者进行分流。细胞学检测的特异性从86%到100%不等，但观察者之间的敏感性从30%到87%不等，观察者间一致率较低。HPV检测对宫颈癌及其癌前病变的敏感性高达95%。HPV检测可以延长筛查间隔，但特异性低于细胞学。 诊断为ASCUS/ LSIL的患者可进展为CIN 2+。由于HPV检测的特异性较低，许多患者会进行阴道镜检查，尤其是在30岁以下的年轻女性中，高危HPV（HR-HPV）感染率较高。在LSIL患者中，HR-HPV患病率约为80%-85%。患者要么直接转诊阴道镜，要么进行细胞学随访。根据FDA关于初次HPV筛查的指南，HPV16/18阳性的患者应立即进行阴道镜检查，而HR-HPV阳性但HPV16/18阴性的妇女则进行细胞学检查。如果细胞学检查呈阴性，12个月后随访。许多HPV阳性的患者由于细胞学敏感性较低，需要重复细胞学随访。因此，需要更有效的标记物来从HPV阳性但细胞学正常或HPV16/18阴性但细胞学诊断为ASCUS/LSIL的患者中识别出潜在的高级别CIN。 2p16和Ki-67双染细胞学的意义 p16INK4A (p16)是一种肿瘤抑制蛋白，也称为周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A (CDKN2A)，基因位于9号染色体(9p21.3)短臂上。p16可与CDK4、CDK6结合，在细胞周期调控中发挥重要作用。CDK4/6通常与Cyclin D形成蛋白复合物磷酸化pRB。pRB磷酸化后与转录因子E2F1分离，导致E2F1进入细胞核，E2F1诱导靶基因转录促进细胞从G1期进入S期。因此，p16作为CDK抑制剂，通过阻止其与Cyclin D的相互作用，从而阻止细胞周期进展。在HPV感染的细胞中，E7蛋白竞争结合细胞周期调控蛋白pRb，导致pRb释放E2F1，激活细胞周期。E7干扰pRb-E2F1通路，诱导p16在细胞内通过负反馈回路过度表达和积累。宫颈鳞癌中p16的强而弥漫性细胞质和细胞核表达主要与HR-HPV感染有关。因此，p16被认为是持续HR-HPV感染的替代标记物，在大多数宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌中都观察到p16过表达。 Ki-67是一种细胞增殖标记物，胞核非组蛋白，由MKI-67基因编码，在除G0期外的细胞周期各个阶段表达。Ki-67在调节细胞周期进展方面具有多种功能。Ki-67作为一种细胞增殖标志物，其IHC检测对许多肿瘤的预后和预测具有重要的参考价值。 p16是肿瘤抑制因子，Ki-67是增殖的细胞标志物。在正常的细胞周期中，抑制细胞增殖的p16蛋白和细胞增殖标记物Ki-67不会同时表达在同一个细胞内，因此，当同一个宫颈上皮细胞同时表达p16和Ki-67蛋白时，提示该细胞的细胞周期调控失效，细胞异常增殖，可作为宫颈高级别鳞状上皮病变和宫颈鳞癌的指标。无论细胞形态学如何，一个或多个宫颈上皮细胞p16和Ki-67同时染色，即可判读为阳性（图1）。无染色或单独的p16染色和单独的Ki-67染色均为阴性结果。（图2） △? 图1 p16/Ki-67 双染阳性结果 p16/Ki-67双染阳性与HR-HPV感染有关，尤其是HPV 16和18。HPV阳性患者的p16/Ki-67阳性率为78.9%，显著高于9.4%的HPV阴性患者。与其他HR-HPV型别感染病例相比，p16/Ki-67阳性率与HPV16/18感染的相关性强2-4倍。p16/Ki-67双染色阳性也强烈提示CIN2+或HSIL。HR-HPV阳性女性其针对分别为NILM、ASCUS、 LSIL、ASC-H和HSIL的p16/Ki-67双染阳性率分别为3.0%、23.6%、25.8%、78.6%、100.0%。其他研究进一步证实，p16/Ki-67阳性率随着细胞学和组织学异常程度的加重而显著