SN_T 4274-2015国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的三重荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4274—2015国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7 的三重荧光PCR检测方法Detection of Salmonella ,Shigella and Escherichia coliO157 :H7 by triplex real-time PCR at frontier ports2016-01-01 实施2015-05-26 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、刮涂层查真伪 SN/T 4274—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、上海之江生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：樊学军、田绿波、王莹、陈肖潇、石莹、杨雨、倪卫琴、朱旭平、王宁。I SN/T 4274—2015国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的三重荧光PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7三重荧光PCR检测的对象，标本的采集、运输和保存，检测程序及结果报告。本标准适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.17食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验GB4789.18食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验GB/T4789.19食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验GB/T4789.20食品卫生微生物学检验水产食品检验GB/T 4789.21食品卫生微生物学检验冷冻饮品、饮料检验调味品检验GB/T 4789.22食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验GB/T 4789.23糖果、糕点、蜜饯检验GB/T4789.24食品卫生微生物学检验GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1沙门氏菌 Salmonella属肠杆菌科,革兰氏阴性杆菌。菌体大小（0.7μm～1.5 μm）×（2.0 μm～5.0 μm），无芽胞，一般无荚膜，除鸡白痫沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。3.2志贺氏菌Shigella属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小为(0.5 μm～0.7 μm）×（2 μm～3 μm），无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。是人类细菌性痫疾最为常见的病原菌。志贺氏菌所致菌痢的病情较重，以全身中毒症状和下部大肠化脓性炎症为主要特征，严重者可发生感染性休克和（或)中毒性脑病。3.3大肠杆菌 0157:H7 Escherichia coli 0157:H7属肠杆菌科埃希氏菌属属肠杆菌科,革兰氏阴性杆菌。大小(0.4 μm～0.7 um）×（1 μm～3 μm），无芽胞，有普通菌毛与性菌毛。可致人腹泻、出血性结肠炎，5%～10%的病例并发溶血性尿毒综合征1 SN/T 4274—2015(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等。3.4荧光 PCR fluorescence polymerase chain reaction又称为实时荧光 PCR（real-time PCR），实时荧光 PCR方法有多种,本标准采用的是 TaqMan 水解探针法，其原理是在常规PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR扩增时，利用Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。3.5Ct 值 cycle threshold即循环阈值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR:聚合酶链反应(polymerase chain reaction)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)MGB:小沟结合物，一种荧光淬灭基团（minor groove binder)5 检测对象5.1疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌 O157:H7 感染者的临床标本如粪