SNT 2074-2008主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2074—2008主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法Protocol of the qualitative polymerase chain reaction(PCR)for detectinggenetically modified component in familiar edible fungi2008-04-29发布2008-11-01实施中华人民共和国发布亲香数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2074--2008前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局本标准主要起草人：陈文炳、邵碧英、江树勋、李寿崧、朱晓南、郭立新、杨婕。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2074—2008主要食用菌中转基因成分定性PCR 检测方法范围1本标准规定了主要食用菌中转基因成分检验的抽样、制样、定性 PCR检测方法。本标准适用于对主要食用菌（杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双孢蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇-金顶侧耳-茶树菇-竹荪黑木耳、白木耳等)中转基因成分的检测。规范性引用文件2 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是环注日期的引文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法（GB/TneqISO3696:1987)SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3缩略语下列缩略语适用于本标准3.1NOS nopaline synthase gengrobacterium tumefacie来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶基因3. 2BAR phosphinothricin acetyltransferase gene from Bacillus amylolique faciens来源于杆菌Bacillus amylolique faciens/草丁麟乙酰转移酶基因。3.3GUS β-glucuronidase geneβ-葡糖醛酸酶基因(作为植物基因表达的报告基因)3.4neomycin-3-phosphotransferase geneNPT I来自大肠杆菌K12 菌株的新霉素-3-磷酸转移酶ⅡI基因。3.518SrDNA编码 18SrRNA(核糖体)的 DNA。4·原理样品经过提取 DNA后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，对外源基因的DNA片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。1 SN/T 2074—20085 试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。2%CTAB缓冲液:20 g/L CTAB,0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0),20 mmol/L EDTA(pH8.0)。5.125.2Tris 饱和酚或水饱和酚。5.3三氯甲烷。5.4异戊醇。5.5异丙醇。5.6无水乙醇。5.770%乙醇。5.8TE 溶液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH8. 0)。5.9Rnase A(10 μg/mL)。5.10蛋白酶 K(20 mg/mL)。5.11琼脂糖：电泳纯。5.12三羟甲基氨基甲烷(Tris）。5.13氯化钠溶液(1.0 mol/L）。5.14 EDTA(pH8.0):乙二胺四乙酸。5.1510×PCR缓冲液（含25mmol/L氯化镁）。dNTPs 溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTP 各 2.5 mmol/L。5.165.17Taq DNA 聚合酶。引物:检测转基因食用菌内、外源基因的引物序列及相关信息见表1。5.18表 1 PCR 引物与 PCR 产物扩增长退火温提示基因名称基因来源引物序列度/℃度/ bp5-TCT GCC CTA TGA ACT TTC GAT GGT A-354 13718SrDNA内源5-AAT TTG CGC ATT GTG CGT CA-35-ATC GTT CAA ACA TTT GGC A-316554 终止子 NOS外源5-ATT GCG GGA CTC TAA TCA TA-35-ACA AGC ACG GTC AAC TTC C-354目的基因398BAR外源 5-AAA CCC ACG TCA TGC CAG TTC-35-GGT CAG TCC CTT ATG TTA CG-35454