大肠杆菌的冷冻干燥保存.pdfVIP

步骤： 1 各种物品的准备与高温蒸汽灭菌 2 菌种的培养:LB 液体培养基24h 3 离心 4 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬 液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞 所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 5 真空冷冻干燥。 大肠杆菌的冷冻真空干燥法 【试剂与器材】1．菌种 : 保存的大肠杆菌 2．培养基： LB 液体培养基 3 ．溶液或试剂 :脱脂奶粉 4 ．仪器或其他用具 1ml 枪头、无菌滴管，冻干管 （青霉素瓶），普通冰箱， 低温冰箱(-30℃)、离心机、离心管、锥形瓶、试管、灭菌锅、烘干箱等。 【操作步骤】 1．准备冻干管 ：青霉素瓶 （5ml ）用蒸馏水冲洗1～2 次，加四层纱布封口后，121℃灭菌 30min 备用。配制保护剂 ：将脱脂奶粉配成10%乳液, 115℃，灭菌10min,随机抽样进行无 菌检查,确认无菌后方可使用。 2．培养菌种 ：将要保存的菌种接入 LB 斜面培养基中，36±1℃培养 24h 后，镜检后转接 LB 液体培养基36±1℃培养24h 。 3．离心（细胞收集）：将长好菌的液体培养基分装灭过菌的离心管，6000r/min 离心10min。 4. 加保护液：每100ml 培养基离心出的细胞加入5-10ml 保护液混匀。 5 、分装样品：用灭过菌的 1ml 枪头吸取加过菌的保护剂，注入到冻干管中 （2mL ）。 6．预冻 ：将加好保护剂的冻干管盖上胶盖封上纱布放于饭盒中，置于-30℃冰柜冷冻24h-48h 即可。 7．冷冻真空干燥: 启动冷冻真空干燥机制冷系统。当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的 样品在无菌条件下打开胶盖 （不拿下来，留一个缝隙即可）封好纱布，迅速放入冻干机钟罩 内，启动真空泵抽气直至样品干燥（约24h ）。 8．取出样品 ：先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与 室内气压相等后打开钟罩，取出样品。先取几只冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散．说 明干燥程度达到要求。若用力颠，样品不与内壁脱开，也不松散，则需继续冷冻真空干燥， 此时样品不需事先预冻。 9. 熔封 用高频电火花真空检测仪检测冻干管内的真空程度。当检测仪将要触及冻干管时， 发出蓝色电光说明管内的真空度很好，便在火焰下(氧气与煤气混合调节，或用酒精喷灯)熔 封冻干管。（青霉素瓶不用这步） 10. 检测存活性 每个菌株取 1 支冻干管及时进行存活检测。打开冻干管，加入0.2m1 无菌 水，用毛细滴管吹打几次，沉淀物溶解后(丝状真菌、酵母菌则需要置室温平衡 30 min～ 60min)，转入适宜的培养基培养，根据生长状况确定其存活性，或用平板计数法或死活染色 方法确定存活率,如需要可测定其特性。 11．保存 置4 ℃或室温保存(前者为宜) 。隔时进行检测。 12．取用冻干管时，先用75 ％乙醇将冻干管外壁擦干净，再用砂轮或锉刀在冻干管上端画 一小痕迹，然后将所画之处向外，两手握住冻干管的上下两端,稍向外用力便可打开冻干管， 或将冻干管近口烧热，在热处滴几滴水，使之破裂，再用镊子敲开。 【注意事项】样品干燥的程度对菌种保存的时间影响很大。一般要求样品的含水量为 1%～ 3%，判断方法：外观样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象，对照管完全干燥；指 示剂用 30g/L 的氯化钴水溶液分装冻干管，当溶液的颜色由红变浅蓝后，再抽同样长的时间 即可。 真空冷冻干燥法 将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。 操作步骤如下： 好氧菌冷冻干燥管的制备 • 1 安瓿管准备 安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用 2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至 pH 中性， 干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌 15-20 分钟，备用。 • 2 保护剂的选择和准备 保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及 pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌； 牛奶要先脱脂，用