NY 549-2002赤羽病细胞微量中和试验方法.pdf

ICS,11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 549--2002赤羽病细胞微量中和试验方法Cells microneutralization test for akabane disease2002- 08-27 发布2002-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 549--2002前言赤羽病(akabane disease，又名阿卡斑病)是由赤羽病病毒(akabane disease virus)引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性传染病。该病以流产、早产、死胎、畸形产为特征，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑症。本病的病原是赤羽病病毒,属布尼病毒科布尼病毒属,病毒表面有两种糖蛋白(G1 和G)，它们分别诱导中和抗体和血凝抑制抗体产生。本病的血清学诊断方法为细胞微量中和试验。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。‘本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标推主要起草人：周立桥、李昌琳、封启民、李其平。 NY/T 549--2002赤羽病细胞微量中和试验方法1 范围本标准规定了赤羽病(akabane disease)细胞微量中和试验技术要求。本标准适用于牛、羊赤羽病感染的定性以及免疫群体抗体水平的评估。2材料准备2.196孔细胞培养物，移液器(50 μL、200μL)滴头，无毒透明塑料胶带，小试管。2.2 Vero 细胞或 SVP 细胞。2.3 抗原、标准阳性血清、标准阴性血清。2.4被检血清,无菌采集，不加防腐剂。3操作方法3.1 准备3.1.1取一支已知滴度的赤羽病病毒（AKV)，用199细胞培养液稀释成100TCIDso/50μL，作为工作浓度抗原。3.1.2被检血清、标准阳性血清、标准阴性血清均 56℃灭活 30 min，用199液做 1：4稀释（即50μL血清加人 150 μL199液中)3.1.3按常规微量中和试验法每个样品接种4孔，每孔分别加被检稀释血清和工作浓度抗原各50μL，轻轻振荡培养板使抗原与稀释血清充分混合，将培养板加盖置37℃培养箱内中和1h。3.1.4每孔滴加SVP细胞或Vero细胞悬液（20万/mL)100μL，用透明塑料胶带封板，置37℃温箱内培养,用倒置显微镜观察细胞病变情况(通常 72 h内引起细胞病变)。3.2对照设置每次试验均要设置标准阳性、阴性血清对照、病毒对照、正常细胞对照和抗原实际用量的回归滴度对照。3.2.1标准阳性、阴性血清对照,将已稀释好的标准阳性、阴性血清分别加人培养板 4孔内，每孔50μL，然后各孔加人工作浓度抗原50μL。3.2.2病毒对照：将工作浓度抗原滴加培养板4孔内，每孔50μL，补加细胞生长液50μL。3.2.3将以上三种对照置37℃温箱内1h，然后于各孔内加入100μL细胞悬液，置37℃温箱内培养，72 h后在倒置显微镜下观察结果。3.2.4正常细胞对照：于培养板4孔内各加100μL细胞悬液，然后再于各孔补加细胞生长液100μL。3.2.5抗原实际用量的回归滴度的测定：在每次试验中，应对使用的100TCIDso/50 μL抗原进行实际用量的测定，将工作浓度抗原作10倍递增稀释到10-3，每个稀释度接种4孔，每孔50μL，立即补加细胞生长液50μL，置37℃温箱内1h，然后每孔加人100μL细胞悬液，计算该试验中TCIDs/50μL的实际用量。4结果判定4.1将培养板放置 37℃温箱内培养72 h进行初判,120 h进行终判。在倒置显微镜下检查细胞病变1 NY /T 549—2002(CPE)。当病毒抗原对照、标准阴性血清加抗原对照均出现细胞病变,标准阳性血清加抗原对照,无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，正常细胞对照亦正常，病毒抗原实际用量在 30TCIDso/50 μL～300TCID5o/50 μL范围内方能判定结果,否则被认为无效。4.2判定标准：定性试验判读标准是被检血清在1：4及1：4以上稀释度能使50%及50%以上的细胞孔不出现病变者判为阳性。抗体效价滴定的判读标准是以被检血清的最高稀释 50%及50%以上的细胞孔不出现病变为该被检血清的中和效价。 002 /中华人民共和国农业行业标准赤羽病细胞微量中和试验方法NY/T 549-2002中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行　各地新华书店经售开本880×12301/16　印张1/2字数6于字2002年12月第一版　2002年12月第一次印刷印数 1－1500NY/T 549-2002